Summary
Ici, nous montrons comment faire rétro-orbitaires d'injection chez le poisson zèbre adulte.
Abstract
Le traitement médicamenteux des animaux entiers est un outil essentiel dans tout système modèle pour pharmacologique et chimique des études génétiques. Intraveineuse (IV) est souvent la forme la plus efficace et non invasive de la livraison d'un agent d'intérêt. Dans le poisson zèbre (
Protocol
Partie 1. Préparation du matériel d'injection
- Tg (globine: GFP) cellules:
- Purger poissons donneur adulte à l'aide pipette 10ul enduit d'héparine (1unit/ul) pour les poissons de ponction derrière branchies.
- Aspirer les globules rouges et passer dans le tampon de la cellule (0.9x PBS + 5% de FBS + Pen 1% / Strep).
- Suspension cellulaire filtre sur mailles 40uM et déterminer la concentration de cellules à l'aide hémocytomètre comme décrit précédemment par LeBlanc et al.
- Isoler et remettre dans un tampon de cellule à concentration voulue telle que le volume d'injection final n'est pas plus 5ul. Ici, nous injecter des cellules de 1,5 à 2.000.000 / destinataire.
- Pour le dextrane, le Texas Red ®, dissoudre le colorant dans DPBS pour une concentration d'injection final de 10-12 mg / mL. Régime d'injecter 4 uL par poisson.
Partie 2. Injection
- Anesthetize poissons dans tricaïne (4,2 ml (4mg/ml) les poissons d'eau tricaine/100ml).
- Lavez seringue Hamilton 3-4 fois avant l'injection à l'aide d'éthanol à 70%. Rincez 3-4 fois avec du DPBS 0.9x.
- Placer le poisson face dorsale et face à droite sur une éponge humide.
- Tenez la seringue Hamilton avec votre main droite et avec votre index sur le piston. Doucement à stabiliser le corps du poisson avec votre main gauche.
- Position de l'aiguille avec le biseau vers le haut de telle sorte que, si l'œil du poisson s ont une horloge, l'aiguille pointant serait à la position 07h00 et à un angle de 45 degrés pour les poissons (figure 1).
- Insérer délicatement l'aiguille 1-2 mm dans la position de 7:00 et lentement enfoncer le piston.
- Laisser le poisson dans l'eau pour récupérer l'E3 frais.
- Lavez l'aiguille, comme décrit ci-dessus, entre les injections de réactifs différents.
- Solution cellulaire Flick pour resuspendre les cellules de quelques minutes pour empêcher l'agglutination des cellules.
- Gardez le poisson hors de débit pour 1 semaine avec des changements d'eau chaque jour pour éviter l'infection. Nous gardons poisson dans l'eau aux soins intensifs pour cette période (Stress Coat 10ml + + 5mL pemafix melafix 5ml par 38 litres d'eau E3).
Partie 3. Les résultats représentatifs
Quand elle est réalisée correctement, il est possible de visualiser matériau injecté si elle a été étiquetée en quelque sorte. Par exemple, Tg (globine: GFP) des globules rouges devraient être considérés sous un microscope de dissection fluorescentes circulant dans les vaisseaux du destinataire casper poissons peu après l'injection, comme indiqué dans la figure 2. De même, l'injection d'un dextrane 70kDa, conjugué au Texas Red ® peuvent être visualisés dans le système vasculaire des poissons transparents, immédiatement après l'injection rétro-orbitaire (figure 3). Des cellules de rein de Tg fluorescent (β-actine: GFP) poissons donneur peut également être injecté rétro-orbital en poissons casper bénéficiaires irradiés. Ces cellules seront éventuellement à domicile à la moelle destinataire (figure 4a) et peut ensuite passer à repeupler le rein après plusieurs semaines (figure 4b).
Si l'injection est trop faible ou l'angle de l'aiguille contourne la cavité rétro-orbitaires sinus veineux, matériau injecté peut être visualisée mutualisation autour de l'oeil ou qui coule hors de lui. Alternativement, si l'injection est trop profonde, les poissons peuvent éprouver des dommages aux tissus ou de saignements excessifs, mais ils peuvent toujours récupérer. Quand elle est réalisée correctement, la mortalité après l'injection rétro-orbitale doit être inférieure à 5% du total et les poissons injectés succès de livraison à la circulation sanguine doit être supérieure à 90% des poissons injectés au total.
Figure 1: Illustration de la technique d'injection rétro-orbitaire. L'œil droit du poisson est représenté comme une horloge analogique dans lequel la position sept heures correspond à l'endroit d'injection correcte.
Figure 2: Tg (globine: GFP) des globules rouges circulant dans les vaisseaux de la queue d'un poisson de casper adulte, trois jours après l'injection rétro-orbitaire.
Figure 3: injection réussie d'un dextrane 70kDa conjugué au Texas Red ® utilisé comme colorant produit vascularisation fluorescent dans le poisson adulte transparente, Casper et est facilement visualisé en utilisant la norme de microscopie par fluorescence ensemble des animaux.
Figure 4a: Trois jours après l'injection rétro-orbitale de l'ensemble des cellules de moelle rein de Tg (β-actine: GFP) poissons donateurs, les cellules peuvent être visualisées homing dans la moelle des reins des poissons adultes bénéficiaires irradiés Casper.
Figure4b: Quatre semaines après l'injection rétro-orbitale de l'ensemble des cellules de moelle rein de Tg (β-actine: GFP) de poissons des donateurs, le repeuplement du rein destinataire avec des bailleurs de fonds verts toute cellules de la moelle des reins peuvent être visualisés dans les poissons adultes bénéficiaires irradiés Casper.
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Discussion
Rétro-orbitaire d'injection chez le poisson zèbre adulte donne le meilleur rendement de la livraison du matériel injecté dans le sang avec la plus faible incidence de la mortalité. En raison de la nature de la tache de l'injection, la perforation semble guérir rapidement, réduire l'incidence de l'infection et la quantité de sang perdu. Le site pourrait même être injecté à plusieurs reprises pendant un temps court pour les injections quotidiennes de médicaments, par exemple.
De grandes quantités de médicaments doivent être achetés pour les méthodes de traitement traditionnel de poissons adultes dans lesquels les poissons sont simplement immergés et trempés dans l'eau contenant le médicament d'intérêt. Toutefois, si le médicament est injecté directement dans le sang de l'animal, une quantité beaucoup plus faible est nécessaire pour le traitement, diminuant ainsi les coûts d'expérimentation. Pour certains composés qui sont trop grands pour entrer dans la circulation du poisson par trempage, dans le cas de certains peptides, rétro-orbitaires injection peut aussi être avantageux.
En outre, depuis l'injection RO est plus rapide et plus facile que les techniques d'injection intracardiaque dans le poisson adulte, une autre application de l'injection de RO peut inclure criblage chimique adulte génétique. Ainsi, rétro-orbitaires injection peut grandement faciliter la recherche de poisson zèbre nécessitant la livraison ou chimique.
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Acknowledgments
Ce travail est soutenu par Howard Hughes Medical Institute et une subvention du NIH pour l'étude de l'hématopoïèse embryonnaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
