Live-dissectie van Drosophila Embryo's: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring

Summary

We beschrijven een gestroomlijnde protocol voor het genereren van "filet" bereidingen van Drosophila embryo's van bepaalde genotypen. Dit protocol maakt een efficiënte uitvoering van een variëteit van genetische screens. Het maakt ook een uitstekende visualisatie van structuren in de late embryo.

Abstract

Drosophila embryo's tussen de etappes 14 en 17 van de embryonale ontwikkeling kan gemakkelijk worden ontleed om "filet" preparaten te genereren. In deze voorbereidingen, het centrale zenuwstelsel loopt in het midden, en wordt geflankeerd door het lichaam muren. Veel verschillende fenotypes zijn onderzocht met behulp van een dergelijke preparaten. In de meeste gevallen werden de filets gegenereerd door ontleding van antilichaam-gekleurde vaste hele-mount embryo's. Deze "vaste dissecties" hebben een aantal nadelen, echter. Ze zijn tijdrovend uit te voeren, en het is moeilijk om mutant (GFP-negatief) embryo's sorteren van voorraden waarin mutaties in de loop der GFP balancer chromosomen. Sinds 2002 is onze groep is het uitvoeren van een tekort en ectopische expressie schermen om liganden voor weesreceptoren te identificeren. Om dit te doen, we ontwikkelden gestroomlijnde protocollen voor de live-embryo dissectie en antilichaam kleuring van collecties met honderden gebalanceerde lijnen. We hebben geconcludeerd dat het aanzienlijk efficiënter om fenotypes in grote collecties van de voorraden te onderzoeken door live dissectie dan door vaste dissectie. Met behulp van het protocol hier beschreven, kan een enkel individu opgeleid tot het scherm tot 10 lijnen per dag voor fenotypes, onderzoek 4-7 mutant embryo's van elke regel onder een samengestelde microscoop. Dit maakt de identificatie van mutaties die een subtiele, lage penetrantie fenotypes, omdat tot 70 hemisegments per lijn worden gescoord bij een sterke vergroting met een 40X water-immersie lens.

Protocol

Introductie

Drosophila embryo's tussen de etappes 14 en 17 van de embryonale ontwikkeling kan gemakkelijk worden ontleed om "filet" preparaten te genereren. In deze voorbereidingen, het centrale zenuwstelsel (CZS) loopt in het midden, en wordt geflankeerd door het lichaam muren. De darm is verwijderd. Na kleuring met antilichamen, filets maken veel betere visualisatie van het centrale zenuwstelsel en het lichaam muur structuren (bijv. motor axonen, spieren, perifere sensorische (PNS) neuronen, luchtpijp) dan hele-mount embryo's, omdat er geen weefsel tussenliggende tussen de voorbereiding en de dekglaasje, en omdat filets plat zijn, waardoor de structuren die zich uitstrekken over het hele lichaam muur te worden gevisualiseerd in een brandvlak worden geplaatst. Veel verschillende fenotypes zijn onderzocht met behulp van een dergelijke preparaten. In de meeste gevallen worden de filets gegenereerd door ontleding van vaste, antilichaam-gekleurde hele-mount embryo's. Deze vaste voorbereidingen worden gegenereerd door de volgende stappen: 1) chorion verwijderen met bleekwater, 2) fixatie met paraformaldehyde / heptaan; 3) vitelline membraan verwijderen met methanol, 4) antilichaam kleuring met behulp van immunohistochemie of immunofluorescentie, 5) open plek in glycerol; 6) dissectie met wolfraam naalden. Gedetailleerde protocollen voor kleuring van deze "vaste dissecties" worden gegeven in ref. [1].

Vaste dissecties hebben een aantal nadelen, echter. Ten eerste is het vaak moeilijk om te sorteren vaste, gekleurde mutant (GFP-negatief) embryo's uit voorraad of kruisingen waarin mutaties in evenwicht zijn dan GFP balancers, zelfs als anti-GFP wordt gebruikt voor detectie. Dit is te wijten aan een verscheidenheid van factoren, waaronder de moeder expressie van GFP. Bijvoorbeeld, hebben we gemerkt dat het bijna onmogelijk om vaste, gekleurde homozygoot mutant embryo's sorteren van evenwichtige chromosoom voorraden met behulp van actine-GFP of gordeldier (arm)-GFP balancers. Ten tweede, het is heel tijdrovend om het genereren van hoge kwaliteit vast dissecties. 10-15 per uur is ongeveer net zo snel als de meeste mensen kunnen dit doen. Ten derde, sommige antistoffen niet goed vlek in vaste dissecties, hetzij omdat het antilichaam epitopen zijn gevoelig op te lossen, of omdat een antilichaam dat vlekken zowel interne als externe structuren is "opgezogen" door de externe structuren en dringt niet door de interne structuren ( bijvoorbeeld antilichamen tegen fasciclin III (Fas3)). Ten vierde, live kleuring met receptor fusie-eiwitten tot expressie te detecteren ligand kan niet worden gedaan op vaste preparaten.

Sinds 2002 is onze groep is het uitvoeren van deficiëntie (Df) en ectopische expressie schermen om RPTP liganden te identificeren. Om dit te doen, we ontwikkelden gestroomlijnde protocollen voor de live-embryo dissectie en kleuren van collecties met honderden gebalanceerde lijnen. Kleuring voor weesreceptor liganden met receptor fusie-eiwitten is een gespecialiseerde toepassing die niet in dienst is van veel groepen. Echter, veel groepen gebruik antilichaam kleuring van filets aan embryonale fenotypes te visualiseren. Door onze ontwikkeling van deze methoden, hebben we geconcludeerd dat het aanzienlijk efficiënter om fenotypes in grote collecties van de voorraden te onderzoeken door live dissectie dan door vaste dissectie. Wij hebben gebruik gemaakt leven dissectie van de motor axon, CNS, en spier fenotypes karakteriseren in meer dan 600 Dfs, en hebben ook gekenmerkt zenuwstelsel fenotypen geproduceerd door ectopische expressie van meer dan 400 verschillende celoppervlak en uitgescheiden eiwitten (AW et al. in voorbereiding.; HK. L. et al.., in voorbereiding).

De live dissectie protocollen die we hebben gebruikt hebben in de loop der jaren. Een van de auteurs (KZ) werd voor het eerst kennis met dissectie wonen meer dan 20 jaar geleden door Nipam Patel, die toen een afgestudeerde student in het labo van Corey Goodman's. In meer recente jaren, gebruikten we deze methode om het CZS met anti-Fas3 [2], maar in dienst vaste dissecties voor alle andere experimenten vlek. In 1999, Aloisia Schmid, dan is een postdoc in onze groep, stelde ons voor aan dissectie leven met glazen naalden, die ze gebruikt om de fenotypen te onderzoeken in dubbelstrengs RNA-geïnjecteerde embryo's [3, 4]. Toen we begonnen met het doen van de RPTP ligand-schermen een paar jaar later, hebben we aangepast haar protocollen om een ​​snelle analyse van grote verzamelingen van de voorraden gehandhaafd op GFP balancers mogelijk te maken. We vonden dat GFP-negatieve embryo's kunnen eenvoudig worden gesorteerd van GFP-gebalanceerde voorraden, zelfs wanneer er aanzienlijke maternale GFP-expressie (bijvoorbeeld voor de TM3armGFP balancer), omdat de embryo's worden gesorteerd wonen en subtiele verschillen in de GFP expressie kan gemakkelijk worden gedetecteerd. Onze succesvolle Df scherm voor een Lar ligand wordt beschreven in [5].

Met behulp van onze huidige protocollen, kan een enkel individu getraind scherm 50-10 lijnen per dag voor fenotypes, onderzoek 4-7 mutant embryo's van elke regel onder een samengestelde microscoop. Na het selecteren van de embryo's en arraying, het duurt ongeveer een uur te ontleden 50 embryo's. Deze methode stelt ons in staat te identificeren mutaties die een subtiele, lage penetratience fenotypes, zijn sinds tot 70 hemisegments per lijn scoorde bij een sterke vergroting met een 40X water-immersie lens. Dergelijke fenotypes moeilijk of onmogelijk is om in de schermen van gekleurde hele-mount embryo's te detecteren onder een dissectie microscoop.

We hebben gedefinieerd Df een kit voor het screenen fenotypische dat ongeveer 250 lijnen bevat en vertegenwoordigt ongeveer de helft van het genoom (AW et al.., In voorbereiding). De ontwikkeling van deze set was begonnen als onderdeel van onze scherm van de Bloomington Df kit zoals het bestond in 2002-2003 voor de genen die nodig zijn voor RPTP ligand synthese [5]. In de loop van dit scherm, vervingen we Bloomington kit Dfs waarvoor Df / Df homozygoten niet over een CNS (en dus niet kon worden gescreend CNS ligand expressie) met kleinere Dfs, bij voorkeur moleculair in kaart gebracht, die een betere ontwikkeling had te ontwikkelen.

Df / Df homozygoten van lijnen in onze fenotypische screening kit hebben een normale algemene morfologie in fase 16, waardoor een onderzoeker om systematisch screenen op genen die van invloed zijn de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, de PNS, de spiervezels, de tracheale netwerk, en vele andere weefsels. Enige structuur, expressie patroon, of subcellulaire lokalisatie patroon dat is visualizable met een specifiek antilichaam of GFP marker in fasen 14-16 kunnen worden gescreend op fenotypen het gebruik van deze kit. Dit betekent dat, met behulp van het protocol hier beschreven, kan een persoon besteden ongeveer de helft van zijn / haar tijd aan dit project systematisch scherm de helft van alle Drosophila genen voor elke gewenste embryonale fenotype binnen zes maanden tot een jaar.

A. Drosophila embryo

1. Bereid "Five-Barrel" ei verzameling kamers

Deze kamers bespaart tijd en moeite bij het onderzoek een groot aantal vliegen lijnen.

1. Schik vijf 50ml conische buizen ondersteboven op een onderste gedeelte van een 100 x 15 mm plastic petrischaal en lijm de buizen aan elkaar met siliconen rubber lijm kit.
2. Zodra de lijm is uitgehard, lijm het onderste gedeelte van de petrischaal op de conische uiteinden van de buizen. Vijf conische buizen zal binnen staan ​​van de petrischaal.
3. Met behulp van een hete naald, maken gaten in de buizen voor luchtcirculatie.

2. Bereid ei collectie platen

1. Giet ongeveer 7ml van de druif agar-gel (1%) in elk 100 x 15 mm plastic petrischaal. De ideale dikte van de gel is ongeveer 3-4 mm aan elke conische buis afdichting en vocht zorgen voor 24 uur. Als de gel te dik is, kan het vallen naar beneden als we de plaat te veranderen.
2. Na het afkoelen van de gel borden, dek af en zet deze in de originele plastic petrischaal zak. Strak sluit de zak en bewaar bij 4 ° C.

3. Bereid vliegt

1. Om genoeg eieren voor het eenvoudig selecteren van embryo's van de juiste podium te krijgen, proberen we tot> 50 maagden brengen een kruis, samen met> 20 mannen.
2. Als er een kruis te worden gescreend, meng de mannelijke en vrouwelijke vliegen en te houden in een vlieg voedsel flacon met veel droge gist pellets op de bodem en een dun papier strip (10 X 100 mm, gevouwen in half) geplant in het midden van het eten. De papieren strip zal meer oppervlak en houd de vliegen tegen overmatig vocht.
3. Bewaar de flacons met vliegen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 dagen.
4. Als een voorraad van een fles moet worden gescreend, alleen de overdracht vliegt in de collectie kamer.

4. Overdracht vliegt naar Five-vat ei-collectie kamers.

1. Het etiket van de elk vat van eieren verzamelen kamers.
2. Doe gist plakken op een ei collectie plaat voor elk vat.
3. Bereid 20 inch lang etikettering tape om de kamer en de plaat bij elkaar te houden. Vouw 10 mm van elk uiteinde voor gemakkelijke plaat te veranderen.
4. Injecteer CO _2-gas in de vlieg flacons en overdracht van de vliegen in de gemerkte vaten.
5. Bedek de kamer met het ei collectie platen en druk naar beneden.
6. Tape rond de kamer en de plaat bij elkaar vanaf het midden van de agarplaat. De band wordt overlap op het ei collectie plaat.

5. Verzamelen van embryo's

1. Bereid ei collectie plaat: Doe gist plakken op een ei collectie plaat voor elk vat.
2. Tik op neer de vliegen in ei verzameling kamers en verwijder de tape rond de kamers (Houd de oude plaat strak).
3. Tik op de vliegen weer naar beneden en vervang de oude plaat door een nieuwe.
4. Verzamel embryo's in schuine positie voor 2-4 uur.
5. Vervang het ei collectie plaat op de gewenste tijd.

6. Leeftijd van embryo's

Leg het ei collectie bord ondersteboven op een overdekte Petri plaat met natte 90 mm cirkel papieren filter en te houden op de gewenste temperatuur. Voor de dissecties van fase 16 embryo's van een evenwichtige mutant lijnen, meestal hebben we een collectie in het eind van de ochtend doen, dan uitbroeden van de embryo's voorr> 22 uur bij 19 ° C. Voor gain-of-function studies met de UAS/GAL4 systeem, verzamelen we embryo's bij RT in de middag en incubeer gedurende 16 uur bij 19 ° C. De volgende dag stappen we over de embryo's tot een 29 ° C incubator aan de UAS/GAL4 systeem te activeren voor 1 of 2 uur. Na deze tijd, de embryo's zijn meestal etappe 15, en dit laat voldoende tijd om embryo's voor GFP expressie sorteren en lijn ze op, zodat ze zullen worden in stadium 16, wanneer de dissectie wordt gedaan.

7. Staging embryo's en sorteren voor GFP expressie.

Onderscheid te maken van de genotypen van embryo's, gebruiken we GFP balancers. We onderzoeken dechorionated embryo's op dubbel-stick tape (zie volgende paragraaf) op grond van een Olympus GFP ontleden reikwijdte, en we selecteren voor leeftijd en GFP expressie op hetzelfde moment.

a) GFP sorteren:

1. De 2e chromosoom balancer gebruiken we (CyOarmGFP) heeft GFP gedreven door het gordeldier promotor, die wordt uitgedrukt door het ectoderm. CyOarmGFP heterozygoten zijn olijfgroen, en CyOarmGFP homozygoten zijn helder groen. In een CyoarmGFP voorraad, zijn de embryo's die de balancer gebrek aan gemakkelijk te onderscheiden, omdat ze bijna geen GFP expressie (ze eruit zien als embryo's van een voorraad met geen GFP balancer).
2. De 3e chromosoom Balancer (TM3armGFP) is moeilijker te gebruiken voor het sorteren, want het heeft meer de moeder gereden GFP expressie. Als gevolg daarvan worden de embryo's verdeeld in meer en minder groen categorieën. Met enige oefening, is het meestal eenvoudig om de minder en meer groen embryo's van elkaar te sorteren, maar het is ook noodzakelijk om hen resort met clustering hen en het uitzoeken van het af en toe een embryo's die meer groen dan de anderen (TM3armGFP heterozygoten) na de overdracht aan de agarplaat. Anders zijn er zeker van te zijn een aantal embryo's die zijn van de onjuiste genotype.
3. De X-balancer is FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Dit wordt uitgedrukt in een weefsel-specifiek patroon. De patronen die relevant zijn voor het sorteren in stadia 15 tot 16 zijn de amnioserosa en twee punten van meningsuiting in het hoofd, die de Bolwig het orgel cellen. Helaas, in het stadium waarin men wil sorteren embryo's, de amnioserosa is vervagen en de Bolwig organen van zijn nog niet begonnen te gloeien. Het is dus noodzakelijk om zeer zorgvuldig te kijken naar de embryo's op de band, vaak rollen ze over, om ze te scoren voor GFP, en is het essentieel om hen resort op de agarplaat. Meestal doen we dit twee keer: een keer direct na het verplaatsen van alle de embryo's van de band de plaat, en opnieuw na veroudering aan te gaan en, net voordat voering ze ter voorbereiding op dissectie. Soms hebben we ook opnieuw de schuif onder de GFP omvang na overdracht van de embryo's naar de PBS pool (zie hieronder), omdat visualisatie van GFP is beter onder deze omstandigheden. Dan kunnen we vernietigen embryo's die GFP hebben vlak voor het begin van de dissectie.

b) Staging

Het belangrijkste instrument voor het organiseren van embryo's rond st. 14-16 is darm morfologie. De darm gloeit met autofluorescentie onder de GFP scope. Voorafgaand aan een poging om het podium embryo's, moet men raadplegen naslagwerken of sites die foto's en schema's van embryo's (bijvoorbeeld de Hartenstein en Campos-Ortega groen boek), zodat men begrijpt wat ze eruit moet zien. De ideale podium voor dissectie is wanneer de darmen is verdeeld in drie bands. Voorafgaand aan dat, de darm wordt weergegeven als een blob. Men vaak sorteert embryo's in de blob podium en vervolgens leeftijden ze totdat ze het beste podium voor dissectie. Na de drie-band het podium, de darmen begint te ontwikkelen diagonaal bands de buurt van de staart, en dan spoelen, en het embryo wordt duidelijker. Binnen deze periode, het embryo wordt het moeilijk om te ontleden, want het zal niet plakken op het glas dia. Als men wil aan de late fase ontleden 16/early stadium 17 embryo's, is het noodzakelijk om een ​​groot aantal embryo's ontleden en die darm morfologie worden geassocieerd met embryo's die stok of niet plakken te evalueren. Dit varieert enigszins tussen genotypes ook.

B. Drosophila embryo leven dissectie

1. Embryo dechorionation
   1. Bereid dubbelzijdig plakband en druiven plaat plaat op een dia
   2. Breng de oude embryo's uit de collectie plaat om de dubbelzijdige plakband met behulp van een nat penseel. Gelijkmatig verspreid embryo's.
   3. Dechorionate de embryo's op de dubbelzijdige plakband door walsen ze over deze voorzichtig met een afgestompte dissectie naald. Na dechorionation, zal de embryo's sterker vasthouden aan het uiteinde van de naald dan aan de overige embryo's of naar de chorion, maar niet zo sterk als op de tape, dus een rolt de embryo's op de top van het chorion of op andere embryo's, dan liften het af en transporteert deze naar de druif plaat plaat. Genotypering en staging (zie hierboven voor een gedetailleerde beschrijving) is uitgevoerd tijdens het proces van dechorionation entransfer naar de naald.
   4. Na een toevlucht voor genotype en leeftijd, verplaats de embryo's naar een kleinere rechthoekige plaat van agar, voldoende breed om in de rij van 10-15 embryo's in een rij. Dorsale zijde naar beneden tegen de agar plaat en posterior eindigt gericht naar u toe: Lijn de dechorionated embryo's op deze plaat. We normaal gesproken maken rijen van 5-10 embryo's.
2. Bereid een glijbaan en overdracht van embryo's voor live-dissectie
   1. Snijd een klein rechthoekig stuk dubbelzijdig plakband en plaats deze in de buurt van het ene uiteinde van Super Frost / Plus dia (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Teken een rechthoek (30-40 mm lang, en de volle breedte van de dia) rond de tape met een wax pen, zodat er ~ 3 mm ruimte tussen de was en de tape (Super HT Pap Pen, www.rpicorp. com ) en breng de embryo's uit de druif plaat plaat op de tape, door het omkeren van de dia en zachtjes het verlagen van het op de embryo's, zodat de band in contact komt met de rij-up embryo's (gedaan onder een dissectie scope). De embryo's worden afgestemd, zodat het achterste uiteinde is naar u toe. Zij zullen nu worden dorsale kant naar boven op de dia.
   3. Onmiddellijk 1X PBS (Gibco recept) toe te voegen over de embryo's om de was rechthoek te vullen.
3. Embryo leven dissectie
   1. Met behulp van een glas dissectie naald (gemaakt van een injectienaald), snijd langs de dorsale middellijn, te beginnen vanaf het achterste einde van het embryo.
   2. Poke het voorste einde van het embryo, omhoog en breng de embryo naar de dia totdat het stokken. Houd embryo's in de buffer. Maak een geordende lijn van embryo's op de dia die elke rij wedstrijden op de agar plaat. Organiseren van de rijen, zodat ze passen allemaal op de dia.
   3. Er zijn een aantal mogelijke dissectie sequenties die kunnen worden gebruikt bij het genereren van filets. Mensen meestal hun eigen procedures geoptimaliseerd door middel van het doen van de dissecties zelf. De video toont een volgorde waarin een kleine snede gemaakt aan het achterste einde van het embryo aan de twee zijden van het lichaam muur van elkaar gescheiden. Indien gewenst, kan men ook breken middendarm / einddarm verband met deze gesneden, en verdringen de einddarm uit op de glijbaan op dit moment (in de video, de einddarm verplaatsing is later klaar). Vervolgens worden sneden gemaakt aan elke kant juist achter de hersenen kwabben in om het lichaam wand gescheiden van de hersenen. Afhankelijk van de leeftijd van het embryo, kan men ook nodig om een ​​ondiepe snede te maken naar de dorsale middellijn aan de amnioserosal verbinding tussen het lichaam muren te verbreken.
   4. Dan, voorzichtig plak de klep helemaal dicht van het lichaam muur op de glijbaan, het vermijden van rekken hen of verwijderen van materiaal van het oppervlak. Dit kan het beste gebeuren door alleen de naald op de voorste en achterste hoeken contact op met de dorsale rand van het lichaam muur. De motor axonen strekken zich niet uit zo ver dorsaal, dus in het beste geval zal dit een embryo te produceren met volledig intact ISN takken. In sommige gevallen is de ISN zal worden afgebroken, zelfs met de beste techniek, omdat het embryo niet altijd precies scheiden langs de dorsale middellijn. Als dit juist gebeurt, zal deze methode het behoud van de lichaamswand structuren in segmenten T3-A6 (ongeveer).
   5. Men kan verlaten middendarm op de top van het embryo, en dan te verwijderen uit alle ontleed embryo's na het beëindigen van de dissecties. Dit wordt gedaan door prikken de darmen, verplaatsen uit de buurt van het embryo, en te rekken om de aansluiting te breken naar de voordarm, die ligt onder de hersenen lobben. Of, men kan de darm te verwijderen uit elke dissectie als een geheel compleet. Met mutanten dat abnormale darm ontwikkeling, is het een voordeel om alle ingewanden te verwijderen in een keer na afloop van de dissecties, omdat vrijgegeven eigeel uit de darmen kan het moeilijker maken om later overgebracht embryo's kleven aan de dia na overdracht van de doublestick tape . Het is soms handig om de overdracht van de embryo's te beginnen bij de bodem van de dia (naar u toe) in plaats van aan de bovenkant, zoals eigeel neiging zich te verspreiden naar u toe te wijten aan de typische bewegingen van de naald.
4. Fixatie en immunofluorescentie / immunohistochemie
   1. Op dit punt, kan men ofwel onmiddellijk de embryo's, als men kleuring met antilichamen, of men kan verwijderen van de PBS-en vervang het door fusie-eiwit supernatant, als men is bezig met een live-vlekken experiment om ligand expressie te detecteren. Dit aspect van het experiment wordt in detail beschreven in de methoden en aanvullende methoden delen van de ref. [5].
   2. Hier beschrijven we de fixatie protocol, dat wordt gedaan onmiddellijk of na fusie-eiwit kleuring. Met behulp van twee pipetten Pasteur, vervang dan de PBS met 5% paraformaldehyde in PBS (EMS, Cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Uitwisseling in fix oplossing drie maal, wat betreft het gebruik van ~ 6 ml van de fix oplossing, aangezien een Pasteur pipet bezit1,5-2 ml van de oplossing. Fix voor 45 '.
   3. Verwijder de fix-oplossing, te vervangen door PBS (3 veranderingen), daarna met PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml Fraction V BSA, 3 veranderingen), dan vervang PBT met ~ 200 ul blok oplossing (PBT + 5 % warmte behandeld normale geit serum), vervolgens met de gewenste primaire antilichaam in blok oplossing. Het is zeer belangrijk om niet toe dat de meniscus van de embryo's contact, in het bijzonder terwijl ze in PBS, omdat dit zal vernietigen de dissecties. Na het reinigingsmiddel wordt toegevoegd de embryo's minder gevoelig voor de meniscus. Zo kan men vervangen door de PBT met block door tikken op de glijbaan en blotting het grootste deel van de oplossing door het aanraken van een Kimwipe kort op de hoek van het gebied omsloten door de was. Dezelfde methode kan gebruikt worden om het blok te vervangen door anti lichaam oplossing. Dit minimaliseert overdracht van oplossingen.
   4. Incubeer overnacht bij 4 ° C, vervolgens 3x wassen met PBT (> 15 minuten / was) in een bakje op een schommelende platform (zorg ervoor dat er genoeg zo PBT dat de foto altijd volledig ondergedompeld tijdens het schommelen), reblock zoals hierboven beschreven, voeg 200 ul tweede antilichaam, incubeer 2 uur. bij RT, opnieuw te wassen met PBT. Controleer vlekken (als groene fluorescentie wordt gebruikt) indien gewenst onder het GFP ontleden scope.
   5. Was 2X met PBS (5 '), voeg 500 ul 70% glycerol/1X PBS (gemaakt door het mengen van 35 ml glycerol, 5 ml 10X PBS, en 10 ml water in een 50 ml buis), en duidelijk overnacht bij 4 ° C (of voor 2 uur bij RT). Verwijder de glycerol en op een # 1 dekglaasje aan.

Discussion

We hopen dat deze video demonstratie heeft onze methoden weergegeven voor live-embryo dissectie en kleuring in voldoende detail dat ze nu gemakkelijk kan worden uitgevoerd door een persoon die enige ervaring heeft in Drosophila genetica en embryologie. Natuurlijk zullen veel praktijk nog steeds nodig zijn, vooral voor de dissecties zelf. In onze ervaring, zal iedere persoon die leert de live-dissectie methoden creëren een subtiel ander dissectie protocol waarmee hij / zij het snelst het genereren van hoge kwaliteit gehuld dissecties. Dit proces vergt maanden voor de volledige ontwikkeling. Echter, kunnen de meeste mensen genereren van hoge kwaliteit dissecties na een paar weken van de praktijk.

Hoewel we voor het gebruik van levende dissecties voor screening, kunnen ze niet vervangen vaste dissecties, omdat de vaste dissectie protocollen kunnen worden toegepast op een breder scala van embryonale fase. Bijvoorbeeld, in de analyse van onze Df kit voor de motor axon begeleiding fenotypes, vonden we dat de details van de motor axon takken, waaronder filopodia, kan veel beter gevisualiseerd worden door immunofluorescentie kleuring van leven filets dan met conventionele mierikswortelperoxidase (HRP) immunohistochemische visualisatie van de vaste filets (voor voorbeelden van hoge kwaliteit HRP kleuring, zie de primer van de motor axon begeleiding op onze lab webpagina). Echter, embryo's ouder dan het begin van fase 17 niet houden aan SuperFrost Plus dia's als gevolg van hun ontwikkeling van cuticula. Dus, voor de kwantitatieve analyse van de fenotypes voor de late-ontwikkeling van motorische axon branches, zoals de SNA, we nog steeds rekenen op vaste secties (AW et al.., In voorbereiding).

Op dit moment zijn deze methoden alleen toegepast op een paar problemen door onze groep. Deze omvatten de identificatie en fenotypische analyse van nieuwe genen die betrokken zijn bij het centraal zenuwstelsel en motorische axon begeleiding, de identificatie van weesreceptor liganden, en de identificatie van genen die nodig zijn voor de synthese van epitopen herkend door specifieke mAbs. Echter, vele andere toepassingen worden bedacht, vooral wanneer deze methoden worden gecombineerd met de analyse van onze Df kit en ectopische expressie collectie, of van de collecties die door andere onderzoekers. Zo zou het mogelijk zijn om systematisch te screenen op genen die nodig zijn voor synthese, cellulaire expressie patroon, of subcellulaire lokalisatie van een eiwit dat kan worden gedetecteerd door een hoge kwaliteit antilichaam of een GFP reporter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9