Live dissekering av Drosophila Embryon: Effektivare metoder för screening Mutant Samlingar av Antibody färgning

Summary

Vi beskriver en strömlinjeformad protokoll för att generera "filé" beredningar av Drosophila embryon av vissa genotyper. Detta protokoll möjliggör effektivt genomförande av olika genetiska skärmar. Det gör också utmärkt visualisering av strukturer i det sena embryot.

Abstract

Drosophila embryon mellan stegen 14 och 17 i embryot kan lätt dissekeras för att generera "filé" förberedelser. I dessa förberedelser driver det centrala nervsystemet i mitten, och flankeras av kroppen väggarna. Många olika fenotyper har undersökts med hjälp av sådana preparat. I de flesta fall var de filéer som genereras av dissekering av antikropps-färgade fast hel-fäste embryon. Dessa "fasta dissektioner" har vissa nackdelar, dock. De är tidskrävande att utföra, och det är svårt att sortera mutant (GFP-negativa) embryon från bestånd där mutationer förs över GFP balansblock kromosomer. Sedan 2002 har vår grupp utfört brist och ektopiska skärmar uttryck för att identifiera ligander för föräldralösa receptorer. För att göra detta har vi utvecklat strömlinjeformad protokoll för levande embryo dissekering och antikroppar färgning av samlingar innehåller hundratals balanserade linjer. Vi har dragit slutsatsen att det är betydligt mer effektivt att undersöka fenotyper i stora samlingar av bestånd lever dissektion än av fasta dissekering. Använder protokollet som beskrivs här, kan en enda utbildad individuell skärm upp till 10 rader per dag för fenotyper, granska 4-7 mutant embryon från varje rad i ett sammansatt mikroskop. Detta möjliggör identifiering av mutationer som ger subtila, låg penetrans fenotyper, eftersom upp till 70 hemisegments per linje är brända i hög förstoring med ett 40X vatten nedsänkning lins.

Protocol

Inledning

Drosophila embryon mellan stegen 14 och 17 i embryot kan lätt dissekeras för att generera "filé" förberedelser. I dessa förberedelser driver det centrala nervsystemet (CNS) i mitten, och flankeras av kroppen väggarna. Tarmen tas bort. När färgas med antikroppar, filéer låta mycket bättre visualisering av CNS och kroppens strukturer vägg (t.ex. motorhus axoner, muskler, perifer sensorisk (PNS) neuroner, tracheae) än att göra hela-fäste embryon, eftersom det inte finns någon vävnad ingripa mellan förberedelserna och täckglas, och eftersom filéer är platt, så att strukturer som sträcker sig över kroppen muren ska visualiseras i en enda fokalplan. Många olika fenotyper har undersökts med hjälp av sådana preparat. I de flesta fall är filéer genereras av dissekering av fasta, antikropps-färgade hela montering embryon. Dessa fasta beredningar skapas med följande steg: 1) chorion bort med blekmedel, 2) fixering vid paraformaldehyd / heptan, 3) vitelline membranet avlägsnas med metanol, 4) antikropp färgning med hjälp av immunohistokemi eller immunofluorescens, 5) clearing i glycerol, 6) dissektion med volfram nålar. Detaljerade protokoll för färgning dessa "fasta dissektioner" finns i ref. [1].

Fast dissektioner har vissa nackdelar, dock. För det första är det ofta svårt att sortera fast, färgade mutant (GFP-negativa) embryon från lager eller korsningar där mutationer är balanserade på GFP balancers, även när anti-GFP används för detektion. Detta beror på en mängd faktorer, inklusive moderns uttryck av GFP. Till exempel har vi funnit att det är nästan omöjligt att sortera fast, färgas homozygot mutant embryon från balanserat third kromosom lager med antingen aktin-GFP eller bältdjur (arm)-GFP balanserare. För det andra är det ganska tidskrävande att skapa högkvalitativa fasta dissektioner. 10-15 per timme är ungefär lika snabb som de flesta människor kan göra detta. Tredje, gör missfärga vissa antikroppar inte bra i fasta dissektioner, antingen för att antikroppen epitoper är känsliga att fixa, eller därför en antikropp som fläckar både interna och externa strukturer är "sugit upp" av de externa strukturerna och inte tränga in till interna strukturer ( t.ex. antikroppar mot fasciclin III (Fas3)). Fjärde, lever färgning med proteiner receptorn fusion för att upptäcka ligand uttrycket kan inte göras på fasta preparat.

Sedan 2002 har vår grupp utfört brist (Df) och ektopisk skärmar uttryck för att identifiera RPTP ligander. För att göra detta har vi utvecklat strömlinjeformad protokoll för levande embryo dissekering och färgning av samlingar innehåller hundratals balanserade linjer. Färgning för föräldralösa receptor ligander med proteiner receptorn fusion är ett specialiserat program som inte är anställd av många grupper. Däremot använder många grupper antikropp färgning av filéerna att visualisera embryonala fenotyper. Genom vår utveckling av dessa metoder har vi dragit slutsatsen att det är betydligt mer effektivt att undersöka fenotyper i stora samlingar av bestånd lever dissektion än av fasta dissekering. Vi har använt leva dissekering för att karaktärisera motoriska axonet, CNS och fenotyper muskler i mer än 600 Dfs, och har även präglat nervsystemet fenotyper produceras av ektopisk uttryck för mer än 400 olika cellytan och utsöndrade proteiner (AW et al i beredningen. HK. L. et al. under utarbetande).

Den levande dissektion protokollen har vi använt har utvecklats under åren. En av författarna (KZ) introducerades för första gången att leva dissektion mer än 20 år sedan av Nipam Patel, som då var doktorand i Corey Goodmans labb. På senare år har vi använt denna metod att färga CNS med anti-Fas3 [2], anställd men fasta dissektioner för alla andra experiment. År 1999 introducerade Aloisia Schmid, sedan en postdoc i vår grupp, vi kan leva dissektion med glas nålar, som hon används för att undersöka fenotyper i dubbelsträngat RNA-injicerade embryon [3, 4]. När vi började göra RPTP liganden skärmarna ett par år senare ändrade vi hennes protokoll för att möjliggöra en snabb analys av stora samlingar av lager som hålls under GFP balanserare. Vi fann att GFP-negativa embryon lätt kan sorteras från GFP balanserat lager även om det finns en betydande moderns GFP uttryck (t.ex. för TM3armGFP balansaxel), eftersom embryona sorteras levande och subtila skillnader i GFP uttryck lätt kan upptäckas. Vårt framgångsrika Df skärm för en Lar ligand beskrivs i [5].

Med vår nuvarande protokoll, kan en enda utbildad individuell skärm 50-10 rader per dag för fenotyper, granska 4-7 mutant embryon från varje rad i ett sammansatt mikroskop. När du har valt och arraying embryona, det tar ungefär en timme att dissekera 50 embryon. Denna metod ger oss möjlighet att identifiera mutationer som ger subtila, låg penetrationNCE fenotyper, är sedan upp till 70 hemisegments per linje gjorde i hög förstoring med ett 40X vatten nedsänkning lins. Sådana fenotyper skulle vara svårt eller omöjligt att upptäcka i skärmar av målat hela montera embryon under ett dissekera mikroskop.

Vi har definierat ett Df kit för fenotypisk screening som innehåller omkring 250 linjer och står för ungefär hälften av genomet (AW et al. Under utarbetande). Utvecklingen av detta kit påbörjades som en del av vår skärm i Bloomington Df kit som existerade under åren 2002-2003 för gener som behövs för RPTP ligand syntes [5]. Under den här skärmen ersättas vi Bloomington kit Dfs som Df / DF homozygoter inte utveckla en CNS (och därför inte kunde undersökas för CNS ligand uttrycket) med mindre Dfs, helst molekylärt kartlagda, som hade bättre utveckling.

Df / DF homozygoter från linjer i vår fenotyp screening kit har normala övergripande morfologier i etapp 16, så att en utredare för att systematiskt skärm för gener som påverkar utvecklingen av CNS, PNS, fibrer muskel, luftrör nätet, och många andra vävnader. Någon struktur, uttryck mönster eller subcellulära lokalisering mönster som är visualizable med en specifik antikropp eller GFP markör i steg 14-16 kan screenas för fenotyper med denna sats. Detta innebär att användning av det protokoll som beskrivs här, kan en person spenderar ungefär hälften av hans / hennes tid på detta projekt skärmen systematiskt hälften av alla Drosophila gener för önskad embryonala fenotyp inom sex månader till ett år.

A. Drosophila embryosamlingsgrupp

1. Förbered "Fem-Barrel" Chambers insamling av ägg

Dessa kamrar sparar tid och ansträngning när man undersöker ett stort antal fluglinor.

1. Ordna fem 50mL koniska rör upp och ner på en nedre delen av en 100 x 15 mm plast petriskål och limma rören ihop med silikon tätningsmedel gummi lim.
2. När limmet härdat, limma den nedre delen av petriskålen på koniska ändarna av rören. Fem koniska rör kommer att stå inne i petriskål.
3. Med hjälp av en varm nål, göra hål i rören för luftcirkulation.

2. Förbered plattor insamling av ägg

1. Häll ca 7ml av druv agargel (1%) i varje 100 x 15 mm plast petriskål. Den idealiska tjocklek gel är ca 3-4 mm till försegla varje koniska rör och ge fukt i 24 timmar. Om gelen är för tjock, kan den falla ner när vi byter plattan.
2. Efter svalna gelen plattor, lock och sätta dessa i original plast petriskålen påse. Förslut påsen ordentligt och förvara vid 4 ° C.

3. Förbered flyger

1. För att få tillräckligt med ägg för enkelt val av embryon av rätt stadium försöker vi sätta> 50 jungfrur i ett kors, tillsammans med> 20 hanar.
2. Om ett kors ska kontrolleras, blanda manliga och kvinnliga flugor och hålla i en fluga mat injektionsflaska med massor av torrjäst pellets på botten och en tunn pappersremsa (10 x 100 mm, vikt på mitten) planterade i mitten av maten. Den pappersremsa kommer att ge mer yta och hålla flugorna från fukt.
3. Förvara rören med flugor vid RT i minst 3 dagar.
4. Om ett lager från en flaska som skall kontrolleras, enkelt överföra flyger in i uppsamlingsbehållaren.

4. Överföring flyger till fem fat kammare insamling av ägg.

1. Märk varje fat för insamling av ägg kammare.
2. Sätt jäst klistra på en insamling av ägg plåt för varje fat.
3. Förbered 20 tum lång märkning tejp för att hålla kammaren och plattan tillsammans. Vik 10 mm i varje ände för enkel plåt förändring.
4. Injicera CO _2-gas i gylfen flaskor och överföra flyger in i märkta tunnor.
5. Täck kammaren med insamling av ägg plattan och tryck ned.
6. Tejp runt kammaren och plattan ihop med början från mitten av agarplatta. Bandet kommer att överlappa varandra på insamling av ägg plattan.

5. Samla embryon

1. Förbered tallrik ägg samling: Sätt jäst klistra på en insamling av ägg plåt för varje fat.
2. Tryck ner flugorna i olika avdelningar insamling av ägg och ta bort tejpen runt kamrarna (Håll den gamla plåten ordentligt).
3. Tryck ner flyger igen och byta ut den gamla plattan med nya.
4. Samla embryon i lutande läge för 2-4 timmar.
5. Byt ut plattan insamling av ägg vid önskad tid.

6. Ålder embryon

Placera plattan äggplockningen upp och ner på en täckt Petri tallrik med våta 90 mm cirkel filtrerpapper och hålla önskad temperatur. För dissektioner av etapp 16 embryon från balanserat mutant linjer, vi brukar göra en samling på förmiddagen, sedan Inkubera embryon förr> 22 tim vid 19 ° C. För att få-av-funktion studier med UAS/GAL4 systemet samlar vi embryon vid RT på eftermiddagen och inkubera i 16 timmar vid 19 ° C. Nästa dag vi överför de embryon som en 29 ° C inkubator för att aktivera UAS/GAL4 system för 1 eller 2 tim. Efter denna tid, embryona är mestadels stadium 15, och detta ger tillräckligt med tid att sortera embryon för GFP uttryck och rada upp dem, så att de kommer att vara i stadium 16 då dissektion är klar.

7. Staging embryon och sortering för GFP uttryck.

Att diskriminera de genotyper av embryon, använder vi oss av GFP balanserare. Vi undersöker dechorionated embryon på dubbel-tejp (se nästa avsnitt) inom ramen för en Olympus GFP dissekera omfattning, och vi väljer dem för ålder och GFP uttryck samtidigt.

a) GFP sortering:

1. Den 2: a kromosomen Balansblocket vi använder (CyOarmGFP) har GFP drivs av bältdjur promotor, som uttrycks i hela ektoderm. CyOarmGFP heterozygoter är olivgrönt och CyOarmGFP homozygoter är ljusa gröna. I en CyoarmGFP lager, är de embryon som saknar balansaxel lätt skiljas, för de har nästan inga GFP uttryck (de ser ut som embryon från ett bestånd utan GFP balansblock).
2. Den 3: e kromosomen Balansblocket (TM3armGFP) är svårare att använda för sortering, eftersom den har mer modern kört GFP uttryck. Som ett resultat är de embryon delas in i mer och mindre grön kategorier. Med lite övning är det oftast enkelt att sortera mindre och fler gröna embryon från varandra, men det är också nödvändigt att tillgripa dem genom klustring dem och plocka ut enstaka embryon som är mer grönt än de andra (TM3armGFP heterozygoter) efter överföring till agarplatta. Annars finns det garanterat att bli en del embryon som är fel genotyp.
3. X balansblock FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Detta uttrycks i en vävnad-specifika mönster. De mönster som är relevanta för sortering vid skeden 15-16 är amnioserosa och två punkter av uttryck i huvudet, som är Bolwig orgel celler. Tyvärr, i det skede där man vill sortera embryon är amnioserosa bleknar och Bolwig s organ har ännu inte börjat glöda. Det är därför nödvändigt att titta mycket noga på embryona på bandet, ofta rullar över dem, att göra mål dem för GFP, och det är viktigt att tillgripa dem på agarplatta. Vi brukar göra det två gånger: en gång omedelbart efter att ha flyttat alla embryon från bandet till plattan, och återigen efter åldring i rätt skede, strax innan foder upp dem som en förberedelse för dissekering. Ibland har vi också ompröva glider under GFP omfattning efter överföring av embryon till PBS poolen (se nedan), eftersom visualisering av GFP är bättre under dessa förhållanden. Då kan vi förstöra embryon som har GFP precis innan du påbörjar dissekering.

b) Staging

Det främsta verktyget för stadieindelning embryon i närheten av St. 14-16 är tarmen morfologi. Tarmen lyser med autofluorescens enligt GFP omfattning. Innan man försöker stadium embryon bör man konsultera uppslagsverk eller webbplatser som har bilder och diagram av embryon (t.ex. Hartenstein och Campos-Ortega grön bok), så att man förstår vad de ska se ut. Den ideala scenen för dissektion är när tarmen har delat in i tre band. Dessförinnan verkar tarmen som en enda klump. En ofta sorterar embryon på fläcken stadium och då åldrar dem tills de når den bästa scenen för dissekering. Efter tre-bands skede börjar tarmen att utveckla diagonalt band nära svansen, och sedan spolar, och embryot blir tydligare. Inom denna period, blir embryot svår att dissekera eftersom det inte fastnar på glaset bilden. Om man vill dissekera sent stadium 16/early skede 17 embryon är det nödvändigt att dissekera många embryon och utvärdera vilka tarmen morfologier är förknippade med embryon som sticker eller inte sticka. Detta varierar något mellan genotyper också.

B. Drosophila embryo bor dissektion

1. Embryo dechorionation
   1. Förbered dubbelhäftande tejp och grape platta platta på en bild
   2. Överför åldrarna embryon från samlingen plattan till dubbelhäftande tejp med en våt pensel. Sprid embryon jämnt.
   3. Dechorionate embryona på dubbelhäftande tejp genom att rulla dem över det försiktigt med en trubbig dissekera nål. Efter dechorionation kommer embryon fastnar starkare till slutet av nålen än till andra embryon eller till chorion, men inte lika starkt som till bandet, alltså en rullar de embryon ovanpå chorion eller på andra embryon, sedan lyfter den och överför den till druvan plattan platta. Genotypning och iscensättning (se ovan för detaljerad beskrivning) sker under processen för dechorionation ochöverföring till nålen.
   4. Efter att tillgripa för genotyp och ålder, flytta embryon till en mindre rektangulär platta av agar, med tillräcklig bredd för att rada upp av 10-15 embryon i rad. Rikta in dechorionated embryon på denna platta: ryggsidan ner mot agar plattan och bakre ändar vänd mot dig. Vi gör normalt rader med 50-10 embryon.
2. Förbered en bild och överföra embryon för live-dissektion
   1. Skär en liten rektangulär bit dubbelhäftande tejp och placera den nära ena änden av Super Frost / Plus slide (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Rita en rektangel (30-40 mm lång, och den fulla bredden av bilden) runt bandet med ett vax penna, så att det finns ~ 3 mm utrymme mellan vax och tejp (Super HT Pap Pen, www.rpicorp. com ) och överföra embryon från druvans plattan platta på att bandet, genom att vända på bilden och försiktigt sänka den på embryon, så att bandet kommer i kontakt med uppradade embryon (görs under en dissekera omfattning). De embryon bör anpassas så att den bakre änden är mot dig. De kommer nu att ryggsidan upp på bilden.
   3. Omedelbart lägga 1X PBS (Gibco recept) över embryon för att fylla vaxet rektangeln.
3. Embryo bor dissektion
   1. Med hjälp av en nål glas dissektion (tillverkad av en injektionsnål), skär längs ryggens mittlinje, från den bakre änden av embryot.
   2. Peta den främre änden av embryot, lyft upp och överföra embryot till bilden tills den fastnar. Håll embryon i bufferten. Gör en ordnad rad av embryon på bilden som passar varje rad på agar platta. Ordna raderna så att de alla plats på bilden.
   3. Det finns en rad möjliga dissektion sekvenser som kan användas för att generera filéer. Människor utvecklar vanligtvis sina egna optimerad förfaranden genom att göra dissektioner själva. Videon visar en sekvens där en liten snitt görs i den bakre änden av embryot för att separera de två sidorna av kroppen väggen från varandra. Om så önskas kan en paus också midgut / hindgut samband med detta klipp, och förskjuter hindgut ut på bild i denna tid (i videon, är hindgut förskjutning sker senare). Sedan är nedskärningar på varje sida strax posteriort om hjärnan loberna för att separera kroppen väggarna från hjärnan. Beroende på ålder av embryot, kan man också behöva göra ett grunt skära ner den dorsala mittlinjen att kapa de amnioserosal sambandet mellan kroppen väggarna.
   4. Sedan försiktigt klistra ner lappar med kroppen väggen på bilden, undvika sträcker ut dem eller ta bort material från deras yta. Detta görs bäst genom att endast tillåta nålen komma i kontakt med främre och bakre hörnen på rygg kanterna av kroppen väggen. Motorn axoner sträcker sig inte så här långt dorsalt, så i bästa fall kommer detta att producera ett embryo med helt intakt ISN grenar. I vissa fall ISN kommer att förkortas, även med den bästa tekniken, eftersom embryot inte alltid separat exakt längs ryggens mittlinje. Om det görs på rätt sätt, kommer denna metod att bevara de strukturer som kroppen väggen i segment T3-A6 (ungefär).
   5. Man kan lämna midgut på toppen av embryot, och ta sedan bort det från alla dissekeras embryon efter att ha avslutat alla dissektioner. Detta görs genom att peta i tarmen, tränger den från embryot, och sträcks ut för att bryta sin anslutning till framtarmen, som ligger under hjärnans lober. Eller kan man ta bort tarmen från varje dissekering som en fullbordar den. Med mutanter som har onormal tarmen utveckling är det en fördel att ta bort alla inälvor på en gång efter avslutad dissektioner, därför släpptes äggula från tarmen kan göra det svårare att hålla sig senare-överfördes embryon till bild efter överföring från doublestick bandet . Det är ibland bra att överföra embryon börjar längst ner i bilden (mot dig) snarare än i toppen, så äggulan tenderar att sprida sig mot dig på grund av den typiska rörelser nålen.
4. Fixering och immunofluorescens / immunhistokemi
   1. Vid denna punkt kan man fixa antingen embryon sekunder, om man är färgning med antikroppar, eller man kan ta bort PBS och ersätta det med fusionsprotein supernatanten, om man gör en levande färgning experiment för att upptäcka ligand uttryck. Denna aspekt av experimentet beskrivs i detalj i de metoder och metoder kompletterande delar av ref. [5].
   2. Här beskriver vi fixeringen protokollet, vilket sker antingen direkt eller efter fusionsprotein färgning. Med hjälp av två Pasteur pipetter, byt PBS med 5% paraformaldehyd i PBS (EMS, Kat. # 15.713-S, www.emsdiasum.com). Börsen i fix-lösning tre gånger, vilket innebär att man använder ~ 6 ml fix lösning, eftersom en pasteurpipett innehar1,5-2 ml lösning. Fix för 45 '.
   3. Ta bort fix-lösning, ersätt med PBS (3 ändringar), därefter med PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml Bråk V BSA, 3 förändringar), sedan ersätta PBT med ~ 200 l blocket lösning (PBT + 5 % värmebehandlade normala get serum) och sedan med den önskade primära antikroppen i block lösning. Det är mycket viktigt att inte låta menisken komma i kontakt med embryon, särskilt när de är i PBS, eftersom detta kommer att förstöra dissektioner. Efter rengöringsmedel läggs embryona blir mindre känsliga för menisken. Således kan man ersätta PBT med block genom att vicka på bilden och blotting av sig det mesta av lösningen genom att vidröra en Kimwipe kort till hörnet av det område som omges av vax. Samma metod kan användas för att ersätta blocket med anti kroppen lösning. Detta minimerar överföring av lösningar.
   4. Inkubera över natten vid 4 ° C, tvätta sedan 3X med PBT (> 15 min / tvätt) i ett fack på en gungande plattform (se det finns tillräckligt med PBT så att bilden alltid är helt nedsänkt under gungande), beskrivs reblock som ovan, tillsätt 200 l sekundär antikropp, inkubera 2 tim. vid RT, rewash med PBT. Kontrollera färgning (om grön fluorescens används) om så önskas enligt GFP dissekera omfattning.
   5. Tvätta 2X med PBS (5), lägg sedan till 500 l 70% glycerol/1X PBS (görs genom att blanda 35 ml glycerol, 5 ml 10X PBS, och 10 ml vatten i en 50 ml tub), och klart över natten vid 4 ° C (eller för 2 tim vid RT). Ta bort glycerol och sätta på en # 1 täckglas.

Discussion

Vi hoppas att denna video demonstration har visat våra metoder för live embryo dissekering och färgning tillräckligt detaljerade att de nu kan lätt utföras av en person som har viss erfarenhet av Drosophila genetik och embryologi. Naturligtvis kommer betydande praktiken fortfarande att krävas, främst för dissektioner själva. Vår erfarenhet är att varje person som lär sig leva dissekeringsmetoder skapa ett subtilt annorlunda dissektion protokoll som gör honom / henne att snabbast generera hög kvalitet klädd dissektioner. Denna process kräver månader för full utveckling. Däremot kan de flesta människor generera hög kvalitet dissektioner efter några veckors praktik.

Även om vi gynnar användningen av levande dissektioner för screening, kan de inte ersätta fasta dissektioner, ty fast dissektion protokoll kan tillämpas på ett bredare spektrum av embryonala stadier. Till exempel i analysen av vår Df kit för motor axonet vägledning fenotyper, fann vi att detaljerna i motorn Axon grenar, inklusive filopodia, kan vara mycket bättre visualiseras genom immunofluorescens färgning av levande filéer än med konventionella pepparrotsperoxidas (HRP) immunhistokemiska visualisering av fasta filéer (för exempel på hög kvalitet HRP färgning, se grundfärgen av motor axon vägledning om vårt labb webbsida). Dock kommer embryon äldre än början av etapp 17 håller inte SuperFrost Plus diabilder följd av sin utveckling av nagelband. Således, för kvantitativ analys av fenotyper för sent att utveckla grenar motor axon som SNA, litar vi ändå på fasta dissektioner (AW et al. Under utarbetande).

För närvarande har dessa metoder endast tillämpats på en del problem med vår grupp. Dessa inkluderar identifiering och fenotypisk analys av nya gener involverade i CNS och motoriska axonet vägledning, identifiering av okända receptor ligander och identifiering av gener som behövs för syntes av epitoper erkänns av specifika MAbs. Men många andra tillämpningar är tänkt, särskilt när dessa metoder kombineras med analys av våra Df kit och ektopisk uttryck samlingar eller samlingar som genereras av andra utredare. Till exempel bör det vara möjligt att systematiskt skärm för gener som behövs för syntes, cellulära uttrycket mönster eller subcellulära lokalisering av något protein som kan upptäckas av en hög kvalitet antikropp eller ett GFP reporter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9