Summary
Автоматизированные микрожидкостных Прибор был разработан для циркуляции зарождаются обогащения клетка из периферической крови через лизис эритроцитов, что обеспечивает изоляцию высокого качества образцов без потерю клеток.
Abstract
В этом докладе протокол для автоматизированного микрожидкостных устройств лизиса крови подробно. Циркуляционные ядерных клеток (ЧПУ), в том числе лейкоцитов и эндотелиальных клеток, обеспечивают идеальную платформу для обновления статуса на иммунную состояние человека. Микрожидкостных протокол позволяет для обогащения ЧПУ без селективной потери клеток и подготовки проб изменчивости в связи с пользователем опосредованного действия. Короче говоря, протокол включает устройство изготовление, пробы, устройство установки и запуска крови через микрожидкостных камеры. В устройстве цельной крови быстро смешать с деионизированной водой в течение примерно 10 секунд в 50 мкм х 150 микрон микрожидкостных каналов. В этом промежуток времени эритроциты лизируются вследствие гипотонического условиях. Елочка структур на дно канала обеспечить тщательное перемешивание и экспозиция клеток к постоянной среды. Оставшиеся клетки возвращаются в изотоническом условия на выходе из устройства, фиксируется с помощью 2% параформальдегида, центрифугируют для отдельных эритроцитов мусор с ЧПУ, а также взвешенные в потоке буфера для окрашивания и анализ с помощью проточной цитометрии. Результаты показывают, чистой проточной цитометрии разброс участков с населением ЧПУ сохранены. Значение этого устройства и вступления протокола в изучении и понимании патогенеза заболевания путем анализа населения с ЧПУ. Таким образом, автоматизация, эффективность и простота микрожидкостных протокола продемонстрирована.
Protocol
Часть 1. Микрожидкостных изготовления устройства
Формы кремния мастер микрожидкостных устройств лизиса была создана с использованием стандартных методов фотолитографии с оборудованием в Университете Луисвилля чистых помещений [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, Сан-Рафаэль, Калифорния), была использована для создания маски прозрачности (Fineline Imaging, Колорадо-Спрингс, CO), чтобы создать негативный копии каналов. Микрожидкостных устройств лизис был изготовлен из формы кремния мастер используя мягкие литографии с эластомера поли (диметилсилоксана) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). Эластомер с реплицируются каналов был освобожден, а отверстия канала доступа пробиты с 20-иглы (мелкие детали, Мирамар, штат Флорида.). Пластины PDMS была необратимо связана с стекло с помощью кислородной плазмы и испытан для экспериментов.
Часть 2. Протокол для запуска лизис устройство
После микрожидкостных устройства была изготовлена и испытана, эксперименты с лизисом эритроцитов готовы начать. В следующем разделе подробно протокол для микрожидкостных устройств.
2,1 забора пробы
- Соберите 4 мл крови из локтевой вены среднем, на передней вены предплечья пациента с гепарином в качестве антикоагулянта в двух 2 мл зеленого верхней vaccutainers.
- Отменить первые 2 мл трубки, поскольку она содержит выбили зрелые эндотелиальные клетки (ложные срабатывания).
- Ресуспендируют вторую трубу смешать с гепарином крови, повернув вверх и вниз, сохранять сразу на лед.
- Передача 1 мл крови к 1,5 мл трубки Эппендорф. Процесс крови немедленно (в течение одного часа коллекции).
2,2 премьер микрожидкостных устройств с PBS
- Получить микрожидкостных устройств связан с стекла. Пресс-подходят трубы доступа (мелкие детали, Мирамар, штат Флорида), чуть больший диаметр, в бухтах и выходе (рис. 1).
- Прикрепить 30 калибра иглы шприца (мелкие детали, Мирамар, штат Флорида), чтобы трубы на каждом из входов, обеспечивая макрос микро-интерфейс.
- Заполните 1 мл шприц с 1X PBS и убедитесь, чтобы избавиться от пузырьков, щелкая иглы шприца. Подключите PBS-загружалась 1 мл шприц 1 на входе микрожидкостных устройств. Нажмите шприц, содержащий 1X PBS осторожно рукой, пока раствор не вытекает из входе 2, а затем сразу же зажим входе 2 со стандартным клип связующий офис
- Продолжить нажатием 1X PBS, пока жидкость достигает выходе порта устройства микрофлюидики. Как только решение вытекает из розетки, розетки зажим трубки с другой клип связующего.
- Продолжить нажатием 1 мл шприца до 1X PBS вытекает из входе 3, и зажим входе 3 порта с другой клип связующий офис. Устройство микрофлюидики теперь полностью загрунтовать.
Рисунок 1. Схематическое устройство показывает входы на соответствующие решения и розетки.
2,3 Подготовка шприцевые насосы и решения
- Для калибровки насосы выполните следующие действия:
- Для большой шприц Гарвардского насоса (Гарвард, PHD 22/2000 Часть # 702000): установка диаметром конфигурации до 22,5 мм, скорость потока 600 мкл / мин.
- Для небольшой шприц Гарвардского насоса (Гарвард, Пико Плюс Часть # 702213): установка диаметром конфигурации 4,61 мм, скорость потока 20 мл / мин.
- Наполните одну 30 мл стерильного шприца с деионизированной водой. Это может быть достигнуто путем изъятия решение непосредственно из 50 мл коническую трубку. (Label шприц)
- Заполните второй 30 мл шприц с 2X фосфатным буфером-солевом растворе (PBS), 2% параформальдегида (PFA) с помощью процедуры, описанной в шаге 9. (Label шприц)
- Заполните 1 мл шприц с 1X PBS из аликвоты хранятся в 15 мл конические пробирки, используя процедуру, описанную в шаге 9.
- Подключите 30 мл деионизированной шприц водой входе 2 и 30 мл 2 раза PBS шприц входе 3 (убедитесь, что вы не т ловушку пузырьки в НКТ или микрофлюидики устройства). Снимите зажим с бухты 2 и 3 и выходе трубы. Подключение 1X PBS 1 мл шприца в входе 1. Избегайте введения пузыри, заполнив иглу шприца с жидкостью, соединяющий шприц, и стряхивая иглу шприца, чтобы избавиться от пузырьков.
2,4 эритроцитов лизис
- Установить все шприцы на соответствующую насосы Гарвардский, как указано ниже:
- Установите два 30 мл шприцев (одна из которых содержит стерильный, деионизированной воды, а другая с 2X PBS, 2% PFA) вместе на большой насос шприца Гарварда.
- Установите 1 мл шприца (содержащий 1X PBS), на небольшой насос шприца Гарварда.
- Место выхода трубы в приемник отходов (50 мл коническую трубку с пометкой Wасте).
- Включите большой шприц Гарвардского насоса (с 30 мл шприцы) и дайте ему поработать в течение одной минуты. (Убедитесь Есть нет пузырьков, и отсутствие утечки в устройстве или в трубку).
- Включите небольшой насос шприца Гарварда и дайте ему поработать дополнительную минуту. (Убедитесь Есть нет пузырьков, и отсутствие утечки в устройстве или в трубку). Остановить насосы. Устройство микрофлюидики готов к использованию.
- Удалить 1 мл шприц, содержащий 1X PBS от небольшого насоса шприца Гарварда.
- После получения образца крови, заполнить 1 мл шприца с 0,05 мл стерильного 1X PBS без захвата любого пузырей. Далее, заполните шприц с 0,5 мл крови, полученной из трубки Эппендорф. (1 мл шприца теперь будет содержать конечный объем 0,55 мл крови и 1X PBS буфера.) Примечание: Держите шприц вертикальной при заполнении, чтобы избежать смешивания 0,05 мл PBS с кровью.
- Подключите шприц, содержащий кровь входе 1 и крепление шприца аккуратно (не подталкивать кровь через трубку в устройство) на небольшой шприц Гарвардского насоса (шприц установлен вертикальный в насос).
- Удалить выходе трубки из отходов трубку и положить чистую 50 мл центрифужную пробирку на место и установить его на ведро льда.
- Включите насос большой шприц Гарвардского первый и дайте ему поработать в течение 1 минуты. Начать сбор образцов от розетки в 50 мл центрифужную пробирку.
- Включите небольшой насос шприца Гарварда.
- Как только образец крови в 1 мл шприца полностью путешествовал по устройству, остановка обоих насосов. Это должно занять приблизительно 20 минут.
- Центрифуга собранных образцов в течение 5 минут при 350 мкг при комнатной температуре, вынул.
- Удалить супернатант, помещая кончик пипетки на противоположной стороне белых гранул. Удалить столько супернатант это возможно, особенно эритроцитов мусора, не нарушая белый шарик.
- Ресуспендируют образца в 1 мл буфера потока (1X PBS, 1% BSA [бычьего сывороточного альбумина], 2% PFA) с помощью пипетки вверх и вниз. Передача образца до 1,5 мл трубки Эппендорф.
- Микроцентрифуга собранных образцов в течение 5 минут при 4 мкг при комнатной температуре. Использование же точностью, как и прежде, удалите супернатант.
- Ресуспендируют образца в 1 мл буфера потока на вортексе.
2,5 Подготовка к проточной цитометрии
- Для анализа проб с использованием проточной цитометрии, добавьте 100 мкл образца к трубке проточной цитометрии.
- К 100 мкл образца добавить указанное антитело (обеспечения правильной концентрации).
- Разрешить образца инкубировать 30 минут при температуре 40 С.
- Промыть два раза с потоком буферного до проточной цитометрии. Вымойте шаг включает в себя добавление 250 мкл буфера потока, вортексе, центрифугирования в течение 5 минут при 350 мкг, и удаление супернатанта с одной жидкости поворот потока трубки цитометрии.
- Ресуспендируют осадок в 250 мкл буфера потока. Пример готова для анализа с помощью проточной цитометрии.
Представитель Результаты
Цельная кровь была проходить через микрожидкостных устройств лизиса и последующей обработки протоколу, избавляя эритроцитов и обогащая циркулирующих ядерных клеток (ЧПУ). Идеальный результат даст чистой проточной цитометрии точечной диаграммы с отдельной популяции с ЧПУ. Отображен ниже на рисунках 2 и 3 точечный график сравнения всей выборки крови без эритроцитов лизис эритроцитов и лизис микрожидкостных протокол с топорами, как вперед рассеяния (FSC) по сравнению стороне рассеяния (SSC) свет. Видно, что микрожидкостных протокол обогащения необходимо получить чистую проточной цитометрии точечный график.
Рисунок 2. Проточная цитометрия разброс участок весь образец крови без эритроцитов лизиса с FSC и SSC осей.
Рисунок 3. Проточная цитометрия точечный график циркулирующих ядерных клеток с лизисом эритроцитов микрожидкостных помечены населения с FSC и SSC осей. Регион 1 (красный) представляет лимфоцитов, Регион 2 (зеленого цвета) представляет моноцитов, Регион 3 (синий) представляет гранулоцитов и регион 4 (фиолетовый) до сих пор не описана.
Удаление мусора красные ячейки пипетки в протоколе также имеет важное значение в случае необходимости. Ниже на рисунке 4 точечный график показывает избыток красного мусора клетки. Хотя это не помутнение точечный график, как на рисунке 2, следует учитывать добавил событий из-за эритроцитов мусора в ходе анализа данных.
Рисунок 4. Проточная цитометрия точечный график изображением красного мусора клетка, рассматривается как кластерсобытий в регионе 5 (голубой).
Окрашивание клеток для определенных маркеров фенотипа антител также будет генерировать характерные результаты. В следующем Цифры антитела фенотип пятна на 3 разные популяции лейкоцитов: лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Рисунок 5 изображает популяций лимфоцитов заговор с осями CD3 и CD4. Моноцитов и гранулоцитов показаны на рисунках 6-7 топорами, как ФСБ против CD14 и CD66b, соответственно.
Рисунок 5. Проточная цитометрия точечный график изображением лимфоцитов CD3 и CD4 осей.
Рисунок 6. Проточная цитометрия точечный график изображением моноцитов с ФСБ и CD14 осей.
Рисунок 7. Проточная цитометрия точечный график изображением гранулоцитов с ФСБ и CD66b осей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Автоматизированные микрожидкостных протокол лизиса крови не поступало. В рамках протокола критических шагов стоит упомянуть. В разделе п.2.1, важно, чтобы отменить первый флакон крови, взятой в качестве образца содержит выбили зрелые эндотелиальные клетки, выступая в качестве ложных срабатываний. Также убедитесь, что для запуска крови в течение часа после сбора. Грунтовка микрожидкостных устройств в разделе п.2.2, важно, чтобы сначала избавиться от пузырей. Кроме того, следует избегать введения пузырьков при подключении новых шприцев, игл по всему протокола. При заполнении 1 мл шприц с кровью в разделе п.2.4, надо помнить, чтобы сначала добавить 1X PBS и кровь, все держа шприц вертикально избежать смеси двух решений. Перед началом шприцевой насос нажатием крови, обеспечивают большой шприц насос уже работает, так что система находится на полной скорости. После того как образец завершения работы по устройству и был центрифугировали, тщательно удалить как можно больше супернатант насколько это возможно, включая красный мусор клетки, не затрагивая белый шарик. Наконец, в разделе п.2.5 следовать протоколу производителя с для обеспечения правильной концентрации антител добавляют 100 мкл образца.
Применение микрожидкостных протокол огромны в клинических исследованиях. Допрос иммунного статуса человека в условиях ЧПУ генерирует важную информацию о состоянии здоровья и может помочь в диагностике и понимании патогенеза заболевания. Доступ к таким ЧПУ населения путем сбора крови образца проще и удобнее, чем человеческая анализ выражения, включающего опухолевой ткани. Для изучения этих ядерных клеток, находящихся в обращении надо уметь обогащать населения от других компонентов крови, в том числе эритроцитов, основная функция сообщили устройства. Следовательно, такие исследования могли бы извлечь большую пользу из микрожидкостных протокол лизиса крови.
Значение микрожидкостных протокол возникает с точки зрения приложений. Потому что ядерные обогащения ячейки требуется в клинических исследованиях крови, протокол требует большого опыта и пользовательских опосредованной шаги, которые производит четкие и последовательные результаты очень важно. Микрожидкостных протокол обеспечивает согласованность за счет автоматизации и контролируемое воздействие на клетки суровых условиях. С единообразия среди клинических данных лабораторий будет непосредственно сопоставимыми [2].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Исследования были поддержаны Уоллес H. Coulter Фонд Рано премии Карьера в трансляционных исследований. Благодаря Тиму Эндрюс, детской гематологии / онкологии, за помощь сбора крови образца. Кроме того, благодаря д-р Сэм Wellhausen, Core проточной цитометрии, Джеймс Грэм Браун онкологического центра, за помощь в работе образцы проточной цитометрии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
