Summary
Çekirdekli hücre zenginleştirme hücre kaybı olmadan yüksek kaliteli örnek izolasyonu sağlar eritrosit lizis ile periferik kan dolaşımını sağlamak için otomatik bir mikroakışkan cihaz geliştirildi.
Abstract
Bu raporda, otomatik bir mikroakışkan kan parçalama cihaz için protokol ayrıntılı. Lökosit ve endotel hücreleri içeren çekirdekli hücreleri (CNCs), Sirkülasyon, bireyin bağışıklık durumuna güncelleştirilmiş bir durum için ideal bir platform sağlar. Mikroakışkan protokolü, seçici hücre kaybı ve kullanıcı-aracılı adımları nedeniyle numune hazırlama değişkenliği olmadan CNCs zenginleşmesine olanak sağlar. Kısaca, protokol cihaz imalat, örnek toplama, cihaz kurulumu ve mikroakışkan haznesinden kan çalıştıran içerir. Cihaz içinde tam kan hızla yaklaşık 10 saniye 50 mikron x 150 mikron mikroakışkan kanal için deiyonize su ile karıştırılır. Bu süre içinde a eritrositlerin hipotonik koşulları nedeniyle parçalanmış. Kanalın alt Herringbone yapıları tam karıştırma ve sabit bir ortama hücreleri maruz kalma sağlar. Kalan hücreleri izotonik koşulları, cihazın çıkışında iade, 2% paraformaldehid kullanarak sabit CNCs eritrosit enkaz ayırmak için santrifüj ve akışı, tampon boyama ve flow sitometri ile analiz için askıya. Sonuçlar kaydedilir CNC nüfusa sahip temiz akış sitometri dağılım araziler göstermektedir. Bu cihaz ve protokol önemi CNC popülasyonlarının analizi ile hastalığın patogenezinde çalışma ve anlayış geliyor. Bu nedenle, otomasyon, etkinliği ve mikroakışkan protokol basitliği göstermiştir.
Protocol
Bölüm 1. Mikroakışkan cihaz imalat
Mikroakışkan lizis cihazın bir silikon master kalıp, Louisville temiz Üniversitesi ekipman standart fotolitografik teknikleri kullanılarak yaratıldı [1]. AutoCAD (Autodesk Inc, San Rafael, CA) kanalları negatif kopyaları oluşturmak için bir saydamlık maskesi (Fineline Görüntüleme, Colorado Springs, CO) oluşturmak için kullanılır oldu. Elastomer poli (dimethylsiloxane) (Dow Corning, Midland PDMS) ile yumuşak litografik teknikleri kullanarak silikon ana kalıp mikroakışkan lizis cihaz üretildi. Çoğaltılmış kanalları ile elastomer piyasaya çıktı ve 20-gauge iğne (Küçük Parça, Miramar, FL.) Kanal erişim delikleri delikli edildi. PDMS gofret oksijen plazma ile geri dönüşümsüz bir bardak slayt gümrüklü ve deney için test edildi.
Bölüm 2. Lizis cihazı çalıştırmak için Protokol
Mikroakışkan cihaz imal ve test edildikten sonra, eritrosit lizis ile deneyler için hazırız. Aşağıdaki bölümde ayrıntıları mikroakışkan cihaz için protokol.
2.1 Örnek Toplama
- Iki adet 2 ml yeşil üst vaccutainers antikoagülan olarak heparin ile hastanın ön önkol ven, medyan kübital venden 4 mililitre kan örneği toplayın.
- Yerinden olgun endotel hücreleri (yanlış pozitif) içeren ilk 2 ml tüp atın.
- Aşağı yukarı torna ve kan heparin karıştırmak için ikinci tüp yeniden süspanse; buz üzerinde hemen kaydedin.
- 1 ml kan 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın. (Toplama bir saat içinde) kan örneği hemen işleyin.
PBS ile 2.2 Başbakan mikroakışkan cihaz
- Cam bağlanmış bir mikroakışkan cihaz alın. Giriş ve çıkış (Şekil 1) biraz daha büyük çaplı press-fit erişim boru (Küçük Parça, Miramar, FL).
- Makro mikro arayüzü sağlayarak, her girişler tüp için 30-gauge enjektör iğnesi (Küçük Parça, Miramar, FL) takın.
- 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun ve şırınga iğnesi Flicking baloncuklar kurtulmak için emin olun. PBS yüklenmiş 1 ml şırınga mikroakışkan cihaz girişi 1 bağlayın. Çözüm girişi 2 akana kadar elle hafifçe 1X PBS içeren şırınga itin ve sonra hemen standart bir ofis bağlayıcı klip ile giriş 2 kelepçe
- Ulaşıncaya kadar sıvı Mikroakiskan cihazın çıkış portu 1X PBS iterek devam edin. Çözüm çıkış dışarı akar sonra, başka bir bağlayıcı klip ile çıkış boru kelepçe.
- 1 ml şırınga iterek 1X PBS girişi 3 akana kadar devam edin ve başka bir ofis bağlayıcı klip ile giriş portu 3 kelepçe. Mikroakiskan cihazı artık tamamen hazırdır.
Şekil 1 şematik ilgili çözümleri ve çıkış girişleri gösteren cihaz.
2.3 şırınga pompaları ve çözüm hazırlanması
- Pompaların kalibre etmek için şu adımları izleyin:
- Büyük Harvard şırınga pompası (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702,000): 22.5 mm, 600 ul / dak akış hızı çapı yapılandırmayı ayarlayın.
- Küçük Harvard Şırınga pompası (Harvard, Pico Plus Bölüm # 702.213): çapı 4.61 mm, akış hızı yapılandırması ayarlama 20 ul / dak.
- Biri 30 ml şırınga steril deiyonize su ile doldurun. Bu 50 ml konik tüp doğrudan çözüm çekerek yapılabilir. (Şırınga Etiket)
- 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak 2X, fosfat tamponlu salin (PBS),% 2 paraformaldehid (PFA) ile ikinci bir 30 ml şırınga doldurun. (Şırınga Etiket)
- 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak, 15 ml konik tüpler içinde saklanan alikotları 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun.
- Giriş 2 30 ml deiyonize su şırınga ve girişi 3 30 ml 2X PBS şırınga (tüp veya Mikroakiskan cihaz don t tuzak kabarcıkları emin olun) bağlayın. Girişler 2, 3 ve çıkış boru kelepçe çıkarın. Girişi 1 1X PBS 1 ml şırınga bağlayın. Şırınga iğnesi ile, sıvı dolum, şırınga bağlayan ve baloncuklar kurtulmak için şırınga iğnesi Flicking kabarcıkları tanıtan kaçının.
2.4 Eritrosit lizis
- Aşağıda belirtilen uygun Harvard pompalar tüm şırınga ayarlayın:
- Büyük Harvard şırınga pompası birlikte iki 30 ml şırınga (biri steril, de-iyonize su ve 2X PBS,% 2 PFA içeren) ayarlayın.
- Küçük Harvard şırınga pompası, 1 ml şırınga (1X PBS içeren) ayarlayın.
- Bir atık toplayıcı çıkış boru (w etiketli 50 ml konik tüp yerleştirinizAste).
- Büyük Harvard şırınga pompası (30 ml şırınga ile) açın ve bir dakika boyunca çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun).
- Küçük Harvard şırınga pompası açın ve ek bir dakika çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun). Pompaların durdurun. Mikroakiskan cihazı artık kullanıma hazır.
- Küçük Harvard şırınga pompası 1X PBS içeren 1 ml şırınga çıkarın.
- Bir kan örneği alındıktan sonra, herhangi bir baloncukları yakalama 0.05 ml steril 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun. Daha sonra, 0.5 ml Eppendorf tüp elde edilen kan şırınga doldurun. (1 ml şırınga artık bir son hacmi 0.55 ml kan ve 1X PBS içerecektir.) Not: 0.05 ml PBS kana karışmasını önlemek için doldururken, şırıngayı dik tutun.
- Connect girişi 1 kan içeren şırınga ve küçük Harvard şırınga pompası (şırınga pompası içine dikey olarak monte edilir) (tüp yoluyla kan cihazın içine iterek önlemek) şırınga dikkatle monte.
- Atık tüpten çıkış tüpünü çıkarın ve onun yerine temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne koyun ve bir kova buz ayarlayın.
- Ilk büyük Harvard şırınga pompası açın ve 1 dakika boyunca çalışmasına izin. 50 ml santrifüj tüpü içine prizden örnek toplamaya başlayın.
- Küçük Harvard şırınga pompası açın.
- 1 ml şırınga içinde kan örneği tamamen cihaz üzerinden seyahat sonra, her iki pompa da durdurmak. Bu yaklaşık 20 dakika sürer.
- 5 dakika boyunca toplanan örnek fren kapalı oda sıcaklığında 350 xg'de santrifüjleyin.
- Beyaz pelet karşı tarafında pipet koyarak süpernatantı. Beyaz pelet rahatsız etmeden, mümkün, özellikle kırmızı hücre artıkları gibi çok supernatant olarak çıkarın.
- Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından tekrar numune akışı, tampon 1 ml (1X PBS,% 1 BSA [sığır serum albumin],% 2 PFA) 1,5 ml Eppendorf tüp örnek aktarın.
- 5 dakika oda sıcaklığında 4 xg'de Mikrosantrifüj toplanan örnek. Süpernatant kaldırmak için daha önce olduğu gibi aynı hassasiyette kullanın.
- Vorteks akışı, tampon 1 ml örnek tekrar
Akım sitometri analizi için 2,5 hazırlanması
- Flow sitometri kullanılarak numune analizi için örnek bir akış sitometri tüp 100 ul ekleyin.
- Örnek 100 ul için (doğru konsantrasyonunu sağlamak) belirtilen antikor ekleyin.
- Örnek C. 40, 30 dakika boyunca inkübe izin verin
- Flow sitometri önce akışı, tampon ile iki kez yıkayın. Yıkama adım akışı, tampon 250 ul ekleyerek karıştırın, 5 dakika boyunca 350 xg'de santrifüj ve akış sitometri tüp bir sıvı dönüş ile süpernatant kaldırarak içerir.
- 250 akış tampon ul pelletini tekrar. Flow sitometri ile analiz için örnek hazırdır.
Temsilcisi Sonuçlar
Tam kan, eritrositlerin biniyordu ve zenginleştirici dolaşımdaki çekirdekli hücreleri (CNCs) mikroakışkan lizis cihaz ve post-processing protokol ile işletilmektedir. İdeal sonuçlar ayrı CNC nüfusa sahip bir temiz flow sitometri scatter plot verecektir. Şekil 2 ve 3 altında görüntülenir ve forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ışık gibi eksenleri ile mikroakışkan protokol eritrosit lizis ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği scatter plot karşılaştırmalar. Mikroakışkan zenginleştirme protokolü, temiz bir akış sitometri scatter plot elde etmek için gerekli olduğu görülmektedir.
Şekil 2 Flow sitometri scatter plot FSC ve SSC eksenleri ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği.
Şekil 3 FSC ve SSC eksenleri ile nüfusu etiketli mikroakışkan eritrosit lizis çekirdekli hücreleri dolaşımdaki akış sitometri scatter plot. 1. Bölge (kırmızı) granülositler temsil eden 3. Bölge (mavi), Bölge 2 (yeşil) temsil eden monositler, lenfositler temsil eder, ve 4. Bölge (mor) henüz karakterize edilebilir.
Gerektiğinde protokolde pipet kırmızı hücre enkaz kaldırılması da önemlidir. Aşağıda Şekil 4 kırmızı hücre enkaz bir fazlalık gösteren bir scatter plot. Şekil 2'de scatter plot karaltı olmasa da, bir veri analizi sırasında eritrosit enkaz nedeniyle etkinlikler için hesaba katmalısınız.
Şekil 4 Flow sitometri scatter plot kırmızı hücre artıkları, bir küme olarak tasvirBölge 5 (mavi) olayları.
Belirli antikor fenotip işaretleri Boyama hücreler de karakteristik sonuçlar üretecektir. Lenfositler, monositler ve granülositler: Sayılarla, 3 farklı lökosit için antikor fenotip lekeler vardır. Şekil 5 eksenleri CD3 ve CD4 ile çizilen lenfosit toplulukları gösteriyor. Monositler ve granülositler sırasıyla, FSC karşı CD14 ve CD66b gibi balta ile 6-7 Rakamlarla gösterilmiştir.
Şekil 5 Flow sitometri scatter plot, CD3 ve CD4 eksenleri ile lenfositlerin tasvir .
Şekil 6 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD14 eksenleri ile monositler tasvir.
Şekil 7 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD66b eksenleri granülositler tasvir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Otomatik bir mikroakışkan kan lizis protokol bildirilmiştir. Protokol kapsamında fazlalaştı kritik adımlar. P.2.1 bölümü, örnek yerinden olgun endotel hücreleri içeren yanlış pozitif olarak hareket olarak toplanan ilk kan şişe atmak için önemlidir. Ayrıca toplama bir saat içinde kan örneği çalıştırmak için emin olun. Astar bölümü P.2.2 mikroakışkan cihaz, başlangıçta baloncuklar kurtulmak için önemlidir. Ayrıca, bir protokol boyunca iğne şırınga takarken kabarcıkları almaktan kaçınması gerekir. Bölümü P.2.4 kan ile 1 ml şırınga doldururken, bir iki çözüm karışımı önlemek için şırınga dikey tutarken ilk 1X PBS ve kan, bütün eklemeyi unutmayın gerekir. Kan örneği bastırıyor şırınga pompası başlamadan önce, sistem tam hızda bu yüzden büyük bir şırınga pompası yürütüyor sağlar. Numune cihaz üzerinden çalışması bittikten ve santrifüj sonra, beyaz pelet bozmadan özenle, kırmızı hücre artıkları dahil olmak üzere, mümkün olduğu kadar supernatant mümkün olduğunca kaldırın. Son bölüm P.2.5 antikor doğru konsantrasyon sağlamak için üretici s protokolü takip 100 mcL örnek eklenir.
Mikroakışkan protokol uygulamaları klinik araştırmalarda büyüktür. CNCs açısından, bireyin bağışıklık durumunun sorgulanması, sağlık durumu hakkında önemli bilgiler üretir ve hastalık patogenezinde tanı ve anlayışı ile yardımcı olabilir. Kan örneği toplama yoluyla bu CNC popülasyonları erişim tümör dokuları içeren insan ifade analizleri daha kolay ve daha rahat. Bir sirkülasyon bu çekirdekli hücreleri incelemek için eritrositler, cihazın birincil işlevi de dahil olmak üzere diğer kan bileşenleri, nüfusu zenginleştirmek gerekir. Bu nedenle, bu tür çalışmaların mikroakışkan kan parçalama protokol derece yararlı olacaktır.
Önemi mikroakışkan protokol uygulamaları açısından ortaya çıkmaktadır. Çekirdekli hücre zenginleştirme kan klinik çalışmalarda gerekli olduğundan, biraz uzmanlık ve kullanıcı-aracılı adımları açık ve tutarlı sonuçlar üreten gerektiren bir protokol önemlidir. Mikroakışkan protokol, otomasyon ve zorlu ortamlarda hücreler kontrollü maruz kalma ile tutarlılık sağlar. Klinik laboratuvarlar veri arasındaki uyum ile doğrudan karşılaştırılabilir olacaktır [2].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Araştırma Translasyonel Araştırma Wallace H. Coulter Vakfı Erken Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. Tim Andrews, Pediatrik Hematoloji / Onkoloji, kan örneği toplama konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sam Wellhausen, Sitometrisi Core, James Graham Brown Kanser Merkezi, flow sitometri örnekleri çalışan yardım için teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
