Summary
Un dispositif automatisé microfluidique a été développé pour faire circuler l'enrichissement de cellules nucléées du sang périphérique via lyse des globules rouges qui assure l'isolement de l'échantillon de haute qualité sans perte de cellules.
Abstract
Dans ce rapport, le protocole d'un dispositif automatisé de sang microfluidique lyse est détaillée. Circulants des cellules nucléées (CNC), y compris les leucocytes et les cellules endothéliales, de fournir une plateforme idéale pour une mise à jour le statut de la condition immunitaire d'un individu. Le protocole permet microfluidique pour l'enrichissement de CNC, sans perte de cellules sélectives et de la variabilité due à la préparation d'échantillons par l'utilisateur médiation étapes. Brièvement, le protocole comprend la fabrication de dispositifs, de la collecte de l'échantillon, configuration de l'appareil, et courir le sang dans la chambre microfluidique. Dans le dispositif de sang total est rapidement mélangé avec de l'eau déminéralisée pendant environ 10 secondes dans un canal de 50 microns x 150 microns microfluidique. En ce moment érythrocytes sont lysés durée en raison des conditions hypotoniques. Structures chevrons sur le fond du canal d'assurer un mélange complet et l'exposition des cellules à un environnement constant. Cellules restantes sont retournés aux conditions isotoniques à la sortie de l'appareil, fixe à l'aide de paraformaldéhyde à 2%, centrifugé pour séparer les débris érythrocytaires du CNC, et en suspension dans du tampon de flux pour la coloration et l'analyse par cytométrie en flux. Les résultats montrent propres parcelles de cytométrie en flux de dispersion avec les populations CNC sauvé. Signification de ce dispositif et le protocole vient à l'étude et la compréhension de la pathogenèse de la maladie par l'analyse des populations de CNC. Ainsi, l'automatisation, l'efficacité et la simplicité du protocole de microfluidique sont démontrés.
Protocol
Partie 1. Fabrication de dispositifs microfluidiques
Un moule maître de silicium de l'appareil lyse microfluidique a été créé en utilisant des techniques de photolithographie avec l'équipement de l'Université de Louisville salle blanche [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, Californie) a été utilisée pour générer un masque de transparence (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) pour créer des répliques négatives des canaux. L'appareil a été fabriqué lyse microfluidique de la moule maître de silicium en utilisant des techniques de lithographie molle avec l'élastomère (diméthylsiloxane) poly (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). L'élastomère avec les canaux reproduits a été libéré, et les trous d'accès au canal ont été perforé avec une aiguille de calibre 20 (petites pièces, Miramar, en Floride.). La plaquette a été irréversiblement PDMS collés sur une lame de verre par plasma d'oxygène et testée pour l'expérimentation.
Partie 2. Protocole pour la course dispositif de lyse
Après le dispositif microfluidique a été fabriqué et testé, les expériences avec lyse des globules rouges sont prêts à commencer. La section suivante détaille le protocole pour le dispositif microfluidique.
2.1 Prélèvement des échantillons
- Recueillir 4 millilitres de l'échantillon de sang de la veine cubitale médiane, sur la veine avant-bras antérieur du patient avec l'héparine comme anticoagulant chez les deux 2 ml verte vaccutainers haut.
- Jeter les 2 premiers ml tube car il contient des cellules endothéliales matures délogé (faux positifs).
- Reprendre le deuxième tube pour mélanger avec du sang héparine en tournant haut et en bas; enregistrer immédiatement sur la glace.
- Transférer 1 ml de sang dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. Traiter les échantillons de sang immédiatement (moins d'une heure de la collecte).
2.2 dispositif de Premier microfluidiques avec PBS
- Procurez-vous un dispositif microfluidique collé au verre. Press-Fit tube d'accès (petites pièces, Miramar, Floride) de diamètre légèrement plus grand dans les entrées et de sortie (figure 1).
- Fixer une aiguille de seringue de calibre 30 (petites pièces, Miramar, Floride) pour le tuyau sur chacun des bras de mer, offrant la macro à l'interface micro.
- Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS 1X et veillez à vous débarrasser des bulles en feuilletant l'aiguille de la seringue. Branchez le PBS-chargé seringue de 1 mL d'entrée 1 sur le dispositif microfluidique. Poussez la seringue contenant le PBS 1X doucement par la main jusqu'à ce que la solution coule de l'entrée 2, puis immédiatement pince entrée 2 avec un clip liant de bureau standard
- Continuez à pousser le PBS 1X que le liquide atteint le port de sortie du dispositif microfluidique. Une fois la solution coule de la sortie, serrer le tube de sortie avec un autre clip liant.
- Continuez à pousser la seringue de 1 ml de PBS 1X jusqu'à ce que le sort de l'entrée 3, et pince l'entrée 3 de port avec un autre clip liant bureau. Le dispositif microfluidique est maintenant complètement amorcée.
Figure 1. Schéma du dispositif montrant les entrées pour les solutions respectives et à la sortie.
2.3 Préparation des pompes à seringues et de la solution
- Pour calibrer les pompes procédez comme suit:
- Pour la pompe seringue Harvard grande (Harvard, PHD 22/2000 Partie # 702000): Définir la configuration de diamètre pour 22,5 mm, débit 600 l / min.
- Pour la pompe seringue Harvard petits (Harvard, ainsi qu'une partie de Pico # 702213): Définir la configuration de diamètre pour 4,61 mm, débit 20 l / min.
- Remplissez un seringue de 30 ml avec de l'eau déminéralisée stérile. Ceci peut être accompli en retirant la solution directement sur le tube conique de 50 ml. (Label de la seringue)
- Remplir une seconde seringue de 30 ml avec 2X tampon phosphate salin (PBS), 2% de paraformaldéhyde (PFA) en utilisant la procédure décrite dans l'étape 9. (Label de la seringue)
- Remplir une seringue de 1 ml avec du PBS 1X de la aliquotes stockées dans les 15 ml tubes coniques, en utilisant la procédure décrite dans l'étape 9.
- Connectez la seringue de 30 ml d'eau déminéralisée à l'entrée 2 et le 30 ml de PBS 2X seringue à l'entrée 3 (assurez-vous d'enfiler bulles piège t dans le tube ou d'un dispositif microfluidique). Retirez la pince de criques 2 et 3 et le tube de sortie. Branchez le PBS 1X ml 1 seringue dans l'entrée 1. Évitez d'introduire des bulles en remplissant le aiguille de la seringue avec le liquide, reliant la seringue, et en tapotant l'aiguille de la seringue pour débarrasser des bulles.
2,4 lyse des globules rouges
- Régler toutes les seringues sur les pompes à Harvard, telles que décrites ci-dessous:
- Réglez les deux seringues 30 ml (un contenant stérile, de l'eau déminéralisée et l'autre avec 2X PBS, 2% PFA), ainsi que sur la pompe à Harvard grosse seringue.
- Régler la seringue de 1 ml (contenant du PBS 1X) sur la pompe à Harvard petite seringue.
- Placez le tuyau d'écoulement dans un collecteur de déchets (50 ml tube conique qui est étiqueté wASTE).
- Mettez la pompe à Harvard grosse seringue (avec les 30 seringues ml) et le laisser fonctionner pendant une minute. (Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles et aucune fuite dans l'appareil ou dans le tube).
- Mettez la pompe à Harvard petite seringue et le laisser fonctionner pendant une minute supplémentaire. (Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles et aucune fuite dans l'appareil ou dans le tube). L'arrêt des pompes. Le dispositif microfluidique est maintenant prêt à être utilisé.
- Retirez la seringue de 1 ml contenant du PBS 1X de la pompe Harvard petite seringue.
- Après l'obtention d'un échantillon de sang, remplir la seringue de 1 ml à 0,05 ml de solution stérile PBS 1X, sans piégeage des bulles. Ensuite, remplir la seringue avec 0,5 ml de sang provenant du tube Eppendorf. (La seringue de 1 ml contient maintenant un volume final de 0,55 ml de sang et 1X tampon PBS.) Remarque: Conserver la seringue verticale pendant le remplissage pour éviter de mélanger du PBS 0,05 ml avec le sang.
- Connectez la seringue contenant le sang à l'entrée 1 et monter la seringue avec précaution (éviter de pousser le sang à travers le tube dans l'appareil) sur la pompe à Harvard petite seringue (la seringue est monté verticale dans la pompe).
- Retirez le tube de sortie du tube de déchets et de mettre un tube à centrifuger de 50 ml propres à sa place et le mettre sur un seau de glace.
- Mettez la pompe Harvard grosse seringue premier et le laisser fonctionner pendant 1 minute. Commencer à recueillir l'échantillon de la sortie dans le tube à centrifuger de 50 ml.
- Mettez la pompe Harvard petite seringue.
- Une fois l'échantillon de sang dans la seringue de 1 ml a complètement traversé le périphérique, arrêter les deux pompes. Cela devrait prendre environ 20 minutes.
- Centrifuger l'échantillon recueilli pendant 5 minutes à 350 xg à température ambiante avec l'arrêt de frein.
- Retirer le surnageant en plaçant la pointe de pipette sur le côté opposé de la pastille blanche. Retirer le surnageant que possible, les débris cellulaires surtout le rouge, sans perturber le culot blanc.
- Resuspendre l'échantillon dans 1 ml de tampon de flux (PBS 1X, 1% de BSA [albumine sérique bovine], 2% PFA) par aspiration et refoulement. Transférer l'échantillon à un tube Eppendorf de 1,5 ml.
- Microcentrifugeuse l'échantillon recueilli pendant 5 minutes à 4 xg à température ambiante. Utilisez même précision que, avant d'enlever le surnageant.
- Resuspendre l'échantillon dans 1 ml de tampon de flux par vortex.
2.5 Préparation pour l'analyse par cytométrie en flux
- Pour l'analyse de l'échantillon en utilisant la cytométrie de flux, ajouter 100 ul d'échantillon dans un tube de cytométrie en flux.
- Pour l'ul 100 de l'échantillon ajouter des anticorps spécifiés (veiller à la bonne concentration).
- Laisser l'échantillon à incuber pendant 30 minutes à 40 ° C.
- Laver deux fois avec le tampon de flux avant de la cytométrie de flux. Étape de lavage comprend l'ajout de 250 ul de tampon de flux, vortex, centrifuger pendant 5 minutes à 350 xg, et enlever le surnageant avec un tour du fluide du tube de cytométrie en flux.
- Reprendre le culot dans 250 ul de tampon de flux. L'échantillon est prêt pour l'analyse par cytométrie en flux.
Les résultats représentatifs
Le sang entier a été exécuté à travers le dispositif microfluidique lyse et de post-traitement de protocole, débarrassant des érythrocytes et enrichissante circulant cellules nucléées (CNC). Idéal résultats donneront une parcelle de débit propres cytométrie de dispersion avec les populations CNC séparée. Affiché en dessous dans les figures 2 et 3 sont des comparaisons diagramme de dispersion d'un échantillon de sang total, sans lyse des érythrocytes et avec lyse des globules rouges par le protocole microfluidiques avec des haches en diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à diffusion latérale (SSC) de lumière. On peut voir que le protocole d'enrichissement microfluidique est nécessaire d'obtenir une parcelle de débit propres cytométrie de dispersion.
Figure 2. Nuage de cytométrie en flux d'échantillon de sang total, sans lyse des globules rouges avec le FSC et les axes de la SSC.
Figure 3. Nuage de cytométrie en flux de circulation de cellules nucléées avec une lyse des érythrocytes microfluidique étiquetés par les populations avec le FSC et les axes de la SSC. Région 1 (rouge) représente les lymphocytes, la Région 2 (vert) représente les monocytes, la Région 3 (bleu) représente les granulocytes, et de la Région 4 (violet) n'a pas encore été caractérisés.
Enlèvement de débris de globules rouges à la pipette dans le protocole est également important lorsque cela est nécessaire. Ci-dessous à la figure 4 est un diagramme de dispersion montrant un excédent de débris de globules rouges. Bien que non opacification le nuage de points comme dans la figure 2, on doit tenir compte des événements ajoutée due aux débris érythrocytaires pendant l'analyse des données.
Figure 4. Nuage de cytométrie en flux montrant les débris de globules rouges, considéré comme un pôledes événements dans la région 5 (cyan).
Cellules de coloration pour certains marqueurs phénotype d'anticorps seront également de générer des résultats caractéristique. Dans les figures suivantes sont des taches phénotype anticorps pour trois populations leucocytaires distincts: les lymphocytes, des monocytes et des granulocytes. La figure 5 montre populations lymphocytaires comploté avec les axes CD3 et CD4. Les monocytes et les granulocytes sont présentés aux figures 6-7 avec axes comme le FSC par rapport CD14 et CD66b, respectivement.
Figure 5. Nuage de points représentant la cytométrie de flux avec des lymphocytes CD3 et CD4 axes.
Figure 6. Nuage de la cytométrie de flux illustrant les monocytes avec le FSC et CD14 axes.
Figure 7. Nuage de la cytométrie de flux illustrant les granulocytes avec le FSC et les axes CD66b.
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Discussion
Un protocole de microfluidique automatisée lyse de sang n'a été rapporté. Dans le protocole sont des étapes importantes à noter. Dans la section P.2.1, il est important de jeter le flacon de sang recueillies pour la première que l'échantillon contient des cellules endothéliales matures délogé agissant comme de faux positifs. De plus, assurez-vous d'exécuter l'échantillon de sang dans l'heure de la collecte. Amorçage du dispositif microfluidique dans la section P.2.2, il est important de d'abord éliminer les bulles. De plus, on devrait éviter d'introduire des bulles lors de la fixation de nouvelles seringues aux aiguilles tout au long du protocole. Lors du remplissage de la seringue 1 ml de sang dans la section P.2.4, il faut rappeler d'abord ajouter du PBS 1X et le sang, tout en gardant la seringue verticale pour éviter le mélange des deux solutions. Avant de commencer la pompe seringue poussant l'échantillon de sang, d'assurer la pompe grosse seringue a été courir si le système est à pleine vitesse. Après que l'échantillon ait fini de tourner à travers le dispositif et a été centrifugé, retirez soigneusement le surnageant que possible, y compris les débris de globules rouges, sans perturber le culot blanc. Enfin, dans la section P.2.5 suivi le protocole du fabricant s pour assurer la bonne concentration d'anticorps est ajouté à l'échantillon de 100 mL.
Applications du protocole de microfluidique sont immenses en recherche clinique. Interrogation de l'état immunitaire d'un individu en termes de CNC génère d'importantes informations sur la condition de la santé et peut aider au diagnostic et à la compréhension de la pathogenèse de la maladie. L'accès à ces populations CNC à travers la collecte de l'échantillon de sang est plus facile et plus commode que les analyses d'expression humains impliquant des tissus tumoraux. Pour examiner ces cellules nucléées en circulation il faut être capable d'enrichir les populations des autres composants sanguins, y compris les érythrocytes, la fonction primaire de l'appareil signalé. Ainsi, ces études pourraient profiter grandement de protocole de lyse du sang microfluidique.
Importance du protocole de microfluidique émerge en termes d'applications. Parce que l'enrichissement de cellules nucléées est nécessaire dans les études cliniques de sang, un protocole exigeant peu de compétences et de l'utilisateur médiée par étapes qui produit des résultats clairs et cohérents est importante. Le protocole microfluidique assure la cohérence grâce à l'automatisation et l'exposition contrôlée des cellules à des environnements difficiles. Avec l'uniformité entre les données des laboratoires cliniques seront directement comparables [2].
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Acknowledgments
La recherche a été soutenue par le Prix Wallace H. Coulter Fondation en début de carrière dans la recherche translationnelle. Merci à Tim Andrews, Hématologie / oncologie pédiatrique, pour aider à la collecte de l'échantillon sanguin. Aussi, grâce à Dr Sam Wellhausen, Core cytométrie en flux, James Graham Brown Cancer Center, pour les aider à exploiter des échantillons par cytométrie en flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | ||
| 30-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-301PL-25 | |
| Tygon tubing (.010" ID) | Small Parts, Inc. | TGY-010 | |
| 20-gauge syringe needle | Small Parts, Inc. | NE-201PL-25 | |
| Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000) | Harvard Apparatus | 702000 | |
| Syringe Pump (Harvard Pico Plus) | Harvard Apparatus | 702213 | |
| Flow cytometry tubes | DB Biosciences | 352052 | |
| Antibody stains | DB Biosciences | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | ||
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | ||
| 30 ml tube | Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | ||
| 10X PBS | Fisher Scientific |
References
- White, W. Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD. Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).
- Sethu, P. Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis. Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).
