Summary
Glutamatergic synapses एक सक्रिय मोड से एक मूक मोड के लिए स्विच कर सकते हैं. हम कृंतक न्यूरॉन्स की अलग संस्कृति में है कि presynaptic गतिविधि स्थिति प्रदर्शित FM1 43 डाई की एक fixable फार्म का उपयोग करने के लिए सक्रिय synapses कल्पना और vGluT-1 प्रतिपिण्ड के साथ immunostaining सभी ग्लूटामेट synapses कल्पना कल्पना है.
Abstract
Synaptic plasticity की संभावना तंत्रिका प्रणाली के लिए जानने के लिए और याद है और यह भी एक अनुकूलनशीलता है कि अन्यथा neurotoxic बनने से हानिकारक अपमान रोकता का प्रतिनिधित्व कर सकते करने की क्षमता underlies. हम presynaptic plasticity है कि हिस्से में दिलचस्प है की एक फार्म अध्ययन कर रहा है क्योंकि यह एक presynaptic एस टर्मिनल neurotransmitter ग्लूटामेट युक्त vesicles रिलीज करने की क्षमता का एक डिजिटल स्विचन और बंद के रूप में व्यक्त किया है. यहाँ हम कृंतक हिप्पोकैम्पस से तैयार dissociated सेल संस्कृतियों में presynaptic टर्मिनलों की गतिविधि स्थिति visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. विधि सक्रिय styryl डाई की एक fixable फार्म FM1 43, सामान्यतः synaptic vesicles के लेबल के लिए प्रयोग किया जाता के साथ धुंधला हो जाना का उपयोग synapses का पता लगाने पर निर्भर करता है है. यह धुंधला हो जाना प्रोफ़ाइल vesicular ग्लूटामेट 1 ट्रांसपोर्टर (vGluT 1), सभी ग्लूटामेट synapses सक्रियण स्थिति की परवाह किए बिना लेबल के लिए डिजाइन दाग के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ एक ही टर्मिनलों के immunostaining के साथ तुलना में है. हम पाते हैं कि depolarizing उत्तेजनाओं presynaptic मुंह बंद प्रेरित. synapses कि आधारभूत शर्तों के तहत चुप है की आबादी को लंबे समय तक बिजली के मुंह बंद करने से या शिविर संकेत दे रास्ते के सक्रियण द्वारा सक्रिय किया जा सकता है.
Protocol
संस्कृति तैयारी
- Dissociated प्रसवोत्तर 0 से 3 1 पशुओं दिन से चूहे या माउस hippocampal कोशिकाओं के सेल संस्कृतियों की तैयारी. हमारे न्यूरॉन्स एक अंतर्निहित astrocyte monolayer, जिसमें एक कोलेजन एक संख्या 0 मोटाई coverslip पर फैल परत का पालन करता है बारी का पालन करें. प्लेट वर्ग सेंटीमीटर प्रति लगभग 500 कोशिकाओं के घनत्व में न्यूरॉन्स.
- संस्कृतियों के 10-14 दिनों के लिए विकसित करने के लिए synaptic विकास और परिपक्वता की अनुमति दें. Antimitotic आगे glial विकास गिरफ्तारी AraC के साथ इन विट्रो में 4 दिन में संस्कृतियों समझो. उन्हें दिन में Neurobasal मध्यम प्लस B27 पूरक neuronal अस्तित्व को बढ़ाने के साथ एक आधा माध्यम मुद्रा के साथ 5 इन विट्रो में फ़ीड.
- संस्कृति अवधि के दौरान, कार्यात्मक खामोश synapses की संख्या को बदल डिजाइन उपचार परिचय. हम पाते हैं कि एक सुविधाजनक तरीका ग्लूटामेट synapses (~ 80%) का एक बड़ा प्रतिशत चुप्पी 4 घंटे 30 मिमी पोटेशियम के साथ एक इलाज है. कमजोर depolarizing उत्तेजनाओं के साथ लंबा incubations इसी तरह मुंह बंद 2 को प्रेरित करते हैं. 50 सुक्ष्ममापी forskolin, adenylyl cyclases का एक उत्प्रेरक, के साथ 4 घंटे उत्तेजना आधारभूत 3 मूक टर्मिनल की जनसंख्या को जगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मूक synapses Visualizing
- कक्ष दिन में 10-14 इन विट्रो में इतनी के रूप में अच्छी तरह से अलग neuritic प्रक्रियाओं के साथ एक अपेक्षाकृत कम घनत्व है असतत synaptic प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग टर्मिनलों के दृश्य की सुविधा के लिए चाहिए.
- आसुत जल में 5 मिमी FM1-43FX के एक शेयर समाधान तैयार करें. शेयर 4 में अंधेरे में रखा जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस सभी FM1-43FX का उपयोग कर प्रयोगों भी अंधेरे में किया जाना चाहिए.
- 2 मिनट के लिए संस्कृतियों में एक HEPES buffered खारा 100 मिमी सोडियम क्लोराइड, 2 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 1 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 मिमी, ग्लूकोज और 10 FM1-43FX सुक्ष्ममापी युक्त समाधान में 45 मिमी पोटेशियम क्लोराइड के साथ चैलेंज. यह समाधान भी एक सुक्ष्ममापी NBQX और 25 डी APV सुक्ष्ममापी शामिल postsynaptic रिसेप्टर्स ब्लॉक और आवर्तक संकेत को रोकने चाहिए. यह चुनौती synaptic टर्मिनलों कि exocytosis और endocytosis के सक्षम हैं लेबल जाएगा. चुनौती समय और शक्ति रीसाइक्लिंग पूल 4 में सभी उपलब्ध vesicles के exocytosis के दौर में कम से कम एक कारण के लिए डिजाइन किए हैं. हालांकि, चुनौती टर्मिनलों के अतिरिक्त मुंह बंद के कारण पर्याप्त नहीं है.
- 3 से 5 सेकंड के लिए ही संस्कृति धो, का उपयोग एक ही पोटेशियम क्लोराइड के बिना खारा HEPES बफर है, लेकिन 500 सुक्ष्ममापी साथ Advasep-7 nonspecific डाई 5 को हटाने के लिए. ध्यान दें कि इस कदम के समय Advasep-7 के लंबे समय तक आवेदन के रूप में महत्वपूर्ण है सभी लेबलिंग FM1-43FX के नुकसान में परिणाम देगा. अगले में धोने Advasep-7 बिना पाँच 2 मिनट के अंतराल लिए खारा HEPES buffered.
- 4% और 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2%, 7.4 पीएच glutaraldehyde paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें. कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के साथ धो संक्षेप में, तो पीबीएस में 4% की सामान्य बकरी सीरम और 0.04% Triton एक्स 100-युक्त अवरुद्ध समाधान में 15 मिनट के लिए सेते हैं. ध्यान दें कि FM1-43FX भी बहुत की राशि ट्राइटन X-100 यहाँ और बाद के चरणों में इस्तेमाल किया के प्रति संवेदनशील है. सामान्यतया, FM1-43FX लेबलिंग किसी भी ट्राइटन X-100 के अभाव में सबसे अच्छा है, लेकिन कुछ डिटर्जेंट बाद immunostaining के लिए कोशिकाओं permeabilize के लिए आवश्यक है. हम empirically निर्धारित किया है कि 0.04% एक्स 100 ट्राइटन presynaptically चुप synapses की परीक्षा के लिए इष्टतम है.
- 1:2500 की एकाग्रता पर समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक vGluT-1 एंटीबॉडी पतला. कोमल कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए पतला vGluT - एक एंटीबॉडी में मिलाते / रोटेशन के साथ कोशिकाओं सेते हैं. FM1-43FX डाई के विरंजन को रोकने की पन्नी के साथ अपनी संस्कृति बर्तन को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें.
- कोशिकाओं पीबीएस में दो बार धोएं और फिर एक विरोधी गिनी सुअर FM1-43FX से अलग वर्णक्रमीय विशेषताओं के साथ एक fluorophore दो दाग भेद संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. हमारी प्रयोग के लिए, हम Alexa 555-संयुग्मित सुअर विरोधी गिनी एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में उपयोग करेगा 1:500 पर. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, जबकि कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए.
- कोशिकाओं को धो PBS में चार गुना अधिक है और फिर Fluoromount जी की एक छोटी सी बूंद का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर कवर पर्ची माउंट. पूरबी coverslip करने के लिए सुनिश्चित करें कि इतना है कि कोशिकाओं स्लाइड चेहरा. स्लाइड्स रातोंरात सूखे की अनुमति दें.
- हम अब कर रहे हैं सक्रिय और निष्क्रिय synapses के चित्र प्राप्त करने के लिए तैयार हैं. एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग पर 1.4 संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक x 60 तेल उद्देश्य से तैयार करें. मंच पर एक स्लाइड प्लेस, सुनिश्चित करना है कि coverslip पक्ष उद्देश्य का सामना करना पड़ रहा है. स्लाइड ध्यान केंद्रित करने के बाद, neurites के एक क्षेत्र है कि पीढ़ी घने नहीं है लगता है. यह भी सेल सोम के पास इमेजिंग से बचने की सिफारिश की है, के रूप में अवशिष्ट डाई FM1-43FX वहाँ व्यापक धोने के बाद भी रह सकता है. हमारे प्रयोगात्मक छवियों के लिए, हम आम तौर पर 51 51 microns के एक क्षेत्र आकार में ज़ूम.
- मोल7.8 27 0.3 माइक्रोन कदम के साथ microns की गहराई को कवर एक दिया क्षेत्र के z - ढेर. इस श्रृंखला की हमारी संस्कृति में neurites की मोटाई को कवर करने के लिए पर्याप्त है. Z-ढेर में प्रत्येक चरण के लिए, लेज़र प्रकाश है कि vGluT-1 के लिए एक खुर्दबीन क्षेत्र में सभी glutamatergic synapses की पहचान एंटीबॉडी के immunofluorescence उत्तेजित के साथ पहले स्कैन. एक ही क्षेत्र है FM1-43FX प्रतिदीप्ति के लिए हर कदम पर फिर से स्कैन. तटस्थ घनत्व फ़िल्टरिंग और एक भी प्रयोग के लिए सभी coverslips के बीच photomultiplier लाभ लगातार सेट, जबकि संकेत के संतृप्ति से बचने. हम आम तौर पर एक प्रयोग के लिए ≥ हालत 5 प्रति क्षेत्रों के अधिग्रहण.
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, एक समग्र छवि एकल विमान में z ढेर में परिवर्तित. प्रक्रिया हम इस रूपांतरण के लिए उपयोग एक प्रत्येक पिक्सेल पर किसी भी विमान से अधिकतम तीव्रता के आधार पर छवि पैदा करता है. समग्र छवि thresholded है और vGluT - एक टर्मिनल विश्लेषण के लिए पहचाने जाते हैं FM1-43FX संदर्भ दाग के बिना. सना हुआ क्षेत्रों, puncta के रूप में संदर्भित, हित के क्षेत्रों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं. हम आम तौर पर क्षेत्र 10 प्रति puncta का चयन करें. अगला FM1-43FX चैनल thresholded है और हित के क्षेत्रों में आरोपित हैं. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक संकेत के प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक punctum के क्षेत्र यों के लिए प्रयोग किया जाता है. एक निरपेक्ष पिक्सेल कसौटी या एक प्रतिशत पिक्सेल कसौटी निष्क्रिय synapses से सक्रिय भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रतिनिधि परिणाम
- हमारे संस्कृतियों में, हम पाते हैं कि ग्लूटामेट synapses के 70-80%, vGluT-1 धुंधला द्वारा परिभाषित है, detectable FM1 43 2 धुंधला हो जाना, 6-8 एक्ज़िबिट. मढ़ा छवियों में हरी FM1-43 प्रतिदीप्ति और लाल vGluT-1 धुंधला इस पीले puncta के एक बहुतायत के रूप में परिलक्षित होता है: सह स्थानीयकृत मार्करों के साथ synapses. ये तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
- VGluT (लाल) एक सकारात्मक puncta के लगभग 20-30% (हरा) आधारभूत ऊपर FM1 43 प्रतिदीप्ति है असफल हो जायेगी. ये निष्क्रिय presynaptic टर्मिनलों हैं, और एक उदाहरण arrowhead ने संकेत दिया है.
- Synapses के एक तिहाई आबादी भी मनाया जाएगा. (हरा) के लिए FM1-43 प्रतिदीप्ति लेकिन (लाल) धुंधला vGluT-1 से रहित है. सकारात्मक रहे हैं ये सक्रिय GABAergic synapses हैं और एक उदाहरण तारांकन द्वारा इंगित किया जाता है. ये हमारे विश्लेषण के सबसे अधिक से बाहर हैं, लेकिन vGluT-1 एंटीबॉडी के स्थान में स्पष्ट रूप से एक vesicular GABA ट्रांसपोर्टर एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए अध्ययन कर सकते हैं.
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Discussion
महत्व
- आमतौर पर synapses के लिए एक औसत दर्जे संभावना के साथ ट्रांसमीटर को रिहा द्वारा संचालित लगा रहे हैं. खुद को और दूसरों के द्वारा कार्य यह स्पष्ट करता है कि कुछ synapses neurotransmitter को रिहा करने के लिए आग रोक रहे हैं vesicular neurotransmitter ट्रांसपोर्टर और अन्य प्रमुख presynaptic 2 मार्करों, 6-8 की एक पूर्ण पूरक के बावजूद. हम पहले से पता चला है कि न्यूरॉन्स में बेसल नेटवर्क गतिविधि निष्क्रिय synapses के इस आबादी को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
महत्वपूर्ण कदम
- 500 Advasep 7 सुक्ष्ममापी के साथ एक संक्षिप्त धोने का समावेश काफी FM1-43FX धुंधला की गुणवत्ता को बढ़ाता है. हालांकि, इस धोने के 5 सेकंड से अधिक समय में भी एक मामूली वृद्धि FM1-43FX लेबलिंग के नुकसान में परिणाम देगा.
- FM1-43FX Triton एक्स 100 प्रोटोकॉल के हिस्से immunostaining में इस्तेमाल की राशि के लिए बहुत संवेदनशील है. FM1-43FX लेबलिंग किसी भी ट्राइटन X-100 के अभाव में सबसे अच्छा है, लेकिन कुछ डिटर्जेंट vGluT-1 immunostaining के लिए कोशिकाओं permeabilize के लिए आवश्यक है. हम empirically निर्धारित किया है कि 0.4% Triton एक्स 100 presynaptically चुप synapses की परीक्षा के लिए इष्टतम है.
संशोधन
- एक postsynaptic मार्कर का उपयोग के रूप में एक 3 Rd करने के लिए सुनिश्चित करें vGluT - एक धुंधला सदाशयी synapses का प्रतिनिधित्व करता है दाग कर सकते हैं: पुटिका से लदी टर्मिनलों और postsynaptic रिसेप्टर समूहों के बीच संपर्क का अंक.
- एक भी अखिल synaptic, मार्कर SV2, या vGAT जैसे अन्य presynaptic एंटीबॉडी मार्करों का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं.
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Acknowledgments
इस काम NIH DA018109 अनुदान और MH78823, और वाशिंगटन विश्वविद्यालय के NIH न्यूरोसाइंस खाका कोर अनुदान P30NS057105 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | A red-shifted FM4-64FX is also available, but has not proven as amenable to assays of presynaptic silencing. |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647-conjugated anti-GP | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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