Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Published: January 5, 2010 doi: 10.3791/1681

Summary

Мы покажем, как для записи вспышка ответов от одного конуса мыши, используя всасывания электрода.

Abstract

Палочек и колбочек фоторецепторов в сетчатке отвечают за свет обнаружения. В темноте, циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы во внешнем сегменте являются открытыми и позволяют катионов течь постоянно внутрь через мембрану, деполяризующего клетки. Освещенность вызывает закрытие каналов СПГ, блоки внутрь катионного тока, и таким образом приводит к ячейке гиперполяризации. На основе полярности фоторецепторов, методом всасывания запись была разработана в 1970-х годов, что, в отличие от классического патч-зажим технику, не требует проникновения в мембране

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Создание электродов

  1. Сделать запись электродов использованием съемника микропипетки и польский электродов с отоплением нити под микроскопом. Для мыши конус одноклеточных всасывания записи, внутренний диаметр на конце электрода составляет около 6-7 мкм.
  2. Подготовка электродов сравнения. Взвесьте 1% агара в дистиллированной воде. Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные пипетки (L = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм) с 1% агара использованием шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 минут.
  3. Разрежьте пополам пипетки помощью алмазной ножом.
  4. Замочите электродов в раствор сравнения, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° С.

Настройка эксперимента

  1. Темные адаптировать мышь в черном клетку на ночь.
  2. Подготовка 100 мл раствора ведения и 1 л перфузии раствором (см. ниже) и фильтр решение.
  3. Растворяют 0,1% BSA и 10 мМ глюкозы в 20 мл раствор ссылки.
  4. Калибровка интенсивности света в оптических стимулятор использованием фотометра.
  5. Горы записи камеры на сцене инвертированного микроскопа.
  6. Bubble перфузии раствора с 95% O 2 / 5% CO 2, инкубировать ее в 40 ° С водяной бане для увеличения растворимости СО 2. Решение вытекает из бутылки записи камеры, проходящей через керамический резистор нагревая это до 36-38 ° С. Нагреватель должен быть расположен как можно ближе к записи камеры позиции, желательно на стадии микроскоп.
  7. Настройте регулятор расхода для потока скоростью около 1-1,5 мл / мин.
  8. Заполните записи электрода со ссылкой решение. Вставьте электрод в держатель электрода. Убедитесь Есть нет пузырьков в электроде. Горы держатель на headstage усилителя. Подключите держатель для всасывающего устройства, который построен путем соединения трубки, частично заполненной минеральным маслом в сторону порта из держателя электрода. Другой конец трубки соединен с небольшим резервуаром нефтепродуктов, к которым давление может быть применен в рот.
  9. Подключение электрода к другому полюсу headstage. Привязка тепловые пара (ТС) для электрода сравнения. Убедитесь, что электрод и ТК советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении принимается близко к клетке как это возможно.
  10. Включите ИК-подсветки для визуализации электрода. Электрод рассматривается инфракрасная камера подключена к монитору. Центр электрода изображение на поля зрения и монитора с помощью микро-манипулятором.
  11. Отрегулируйте положение кончика электрода близко (2-4 мм), чтобы кончик электрода записи.
  12. Отрегулируйте напряжение постоянного тока на нагреватель так, чтобы температура раствора составляет около 36-38 ° C.
  13. Выполнить печать, чтобы проверить сопротивление электрода записи, как правило, около 900 кОм.

Изоляция мыши сетчатки

  1. Под тусклый красный свет, эвтаназии темно-адаптированной мышь с CO 2 и цервикальной дислокации. Марк глазные яблоки с помощью иглы горячей факел металла прижигание наиболее спинной точки склеры чуть-чуть. Выявлять глазные яблоки с помощью ножниц. Все последующие процедуры проводятся под инфракрасным излучением.
  2. Hemisect глазных яблок под микроскопом с ИК подсветкой и преобразователей.
  3. Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного насколько это возможно.
  4. Для записи M-конус ответов, удалить вентральной части наглазник 4 с лезвием судя по прижигания марки.
  5. Пил сетчатку от слоя пигментного эпителия.
  6. Свести сетчатки и положите его на дно чашки Петри, заполненные 1-2 решение ссылкой мл.
  7. Нарежьте сетчатки на мелкие тонкие части, используя лезвие бритвы и инкубировать подготовку в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом.

Записи

  1. Выключите обогреватель временно. Коммутатор перфузии поток обойти трубы, чтобы предотвратить камеры от высыхания.
  2. Слейте большую часть раствора в камере используя часть Kimwipe ткани. Передача сетчатки подвески записи камеры с помощью стеклянной пипетки.
  3. Подождите около 2 минут, пока сетчатка ломтиками успокоиться. Коммутатор перфузии обратно. Включите нагреватель.
  4. Включите инфракрасную подсветку для визуализации подготовки. Поиск часть сетчатки лежал на камеру с наружных сегментов фоторецепторов торчащие (см. пример рисунок). Нарисуйте внутренние сегменты мягко в электроде всасывания. В этой конфигурации, несколько ядер и внутренний сегменты должны быть вовлечены в электроде. Запись фотоотклика на яркую вспышку для проверки конуса внутренний сегмент находится в электроде и является ли ячейка исцелитьтвой, судя по реакции кинетики и амплитуды.
  5. Нижняя минеральных водохранилище применить небольшое отрицательное давление до кончика электрода, чтобы помочь провести внутренний сегмент в электроде.
  6. Запись тест-вспышкой ответы от тусклом до ярко интенсивности раз хороший ячейка найдена. Испытание вспышки осуществляется от калиброванного оптического стимулятор 5. Интенсивность вспышки и длины волны контролируются набором фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционной полосы, соответственно. Испытание длительность вспышки (20 мс) управляется компьютером управляемых жалюзи.

Решения

  1. Мышь перфузии решение: 112,5 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 20 мМ NaHCO 3, 3 мМ Na сукцинат, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА и 10 мМ глюкозы.
  2. Мышь записи электрода решение: 140 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 3 мМ HEPES (рН 7,4), 0,02 мМ ЭДТА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Одноклеточный всасывания записи с фоторецепторных клеток был разработан три десятилетия назад. Это дает нам возможность записи трансмембранный ток изменение, вызванное световой стимуляции, не проникая клеточной мембраны. Из-за высокой межклеточной адгезии, трудно выделить одну здоровую палочек и колбочек сетчатки от мыши, как амфибии сетчатки, и трудно найти индивидуальный конусы из-за низкого процента (3%) и небольшого размера. Внутренний сегмент в (IS-в) способ записи позволяет преодолеть эту трудность, тока записи от внутреннего сегментов нескольких фоторецепторов, среди которых конус может быть включен. У диких мышей типа, реакция должна быть комбинация из палочек и колбочек. Постоянный свет фон может быть использовано для подавления стержень ответов. В этом видео мы использовали Tα-/ - сетчатка, в которой стержни не может ответить на световое раздражение, так как они не имеют α-субъединицы G-белка трансдуцином 6. Таким образом, фотоотклик только из конусов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Поддержке развития карьеры награду от исследований в области профилактики слепоты, NIH грант Е.Ю. 019312, и неограниченный грант исследований в области профилактики слепоты и EY 02 687 (кафедра офтальмологии и Визуальный наук в Университете Вашингтона).

References

  1. Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
  2. Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms. J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).
  3. Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
  4. Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
  5. Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
  6. Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681, doi:10.3791/1681 (2010).More

Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681, doi:10.3791/1681 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter