Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Summary

Le mostraremos cómo registrar las respuestas de flash de conos ratón utilizando un electrodo de succión.

Abstract

Fotorreceptores de los bastones y conos en la retina es responsable de la detección de la luz. En la oscuridad, los nucleótidos cíclicos-cerrada (CNG) de canales en el segmento externo están abiertos y permiten el flujo de cationes a ritmo constante hacia el interior a través de la membrana, despolarización de la célula. Exposición a la luz desencadena el cierre de los canales de GNC, bloquea el flujo de cationes corriente de entrada, por lo que resulta en la hiperpolarización de la célula. Con base en la polaridad de los fotorreceptores, un método de grabación de succión se desarrolló en 1970 que, a diferencia de la clásica técnica de patch-clamp, no requiere penetrar en la membrana plasmática

Protocol

Hacer electrodos

1. Hacer los electrodos de registro utilizando un extractor de micropipeta y pulir los electrodos con filamento de calefacción bajo el microscopio. Para la grabación del ratón cono de succión de una sola célula, el diámetro interior en la punta del electrodo es de unos 6.7 micras.
2. Preparar electrodos de referencia. Pesar 1% de agar en agua destilada. Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar las pipetas de vidrio (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) con 1% de agar con una jeringa. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
3. Cortar las pipetas en dos mitades con un cuchillo de diamante.
4. Sumerja los electrodos de referencia en la solución de referencia por lo menos 24 horas a 4 ° C.

Configuración del experimento

5. Dark adaptar un ratón en una jaula de negro durante la noche.
6. Prepare una solución de 100 ml de referencia y una solución de perfusión L (ver abajo) y el filtro de la solución.
7. Disolver 0,1% de BSA y 10 mM de glucosa en 20 ml de solución de referencia.
8. Calibrar la intensidad de la luz del estimulador óptico con fotómetro.
9. Monte la cámara de grabación en la platina del microscopio invertido.
10. La burbuja de la solución de perfusión con 95% O ₂ / 5% CO _2, que se incuba a 40 ° C baño de agua para aumentar la solubilidad de CO _2. La solución de los flujos de la botella a la cámara de grabación que pasa a través de una resistencia de cerámica de calentamiento a 36-38 ° C. El calentador debe colocarse lo más cerca a la cámara de grabación como sea posible, idealmente en la platina del microscopio.
11. Ajuste el regulador de flujo para un caudal de alrededor de 1-1,5 ml / min.
12. Llenar el electrodo de registro con la solución de referencia. Insertar el electrodo en un porta-electrodos. Asegúrese de que no haya burbujas en el electrodo. Monte el soporte en el headstage del amplificador. Conecte el soporte a un dispositivo de succión, que se construye mediante la conexión de la tubería parcialmente llena con aceite mineral para el puerto lateral del porta-electrodos. El otro extremo del tubo está conectado a un pequeño depósito de aceite mineral, a la que la presión se puede aplicar por vía oral.
13. Conecte el electrodo de referencia al otro polo de la headstage. Obligar a la par térmico (TC) para el electrodo de referencia. Asegúrese de que las puntas de los electrodos y TC están muy juntos para que la lectura de la temperatura se toma como cerca de la célula como sea posible.
14. Encienda la iluminación infrarroja para visualizar el electrodo. El electrodo es visto por la cámara de infrarrojos conectada a un monitor. Centro del electrodo de la imagen en el campo visual y del monitor mediante un micromanipulador.
15. Ajustar la posición de la punta del electrodo de referencia cerca (2-4 mm) a la punta del electrodo de registro.
16. Ajustar el voltaje de CC para el calentador de modo que la temperatura de la solución es de 36-38 º C.
17. Realizar una prueba de sello para comprobar la resistencia de electrodo de registro, por lo general alrededor de 900 kW.

Aislamiento de la retina del ratón

18. Bajo tenue luz roja, la eutanasia el ratón adaptado a la oscuridad con el CO ₂ y la dislocación cervical. Marcar los globos oculares con la punta de una antorcha de metal caliente de la cauterización de los punto más dorsal de la esclerótica un poco. Enucleación del globo ocular con unas tijeras. Todos los procedimientos posteriores se realizan bajo la luz infrarroja.
19. Hemisect los ojos bajo el microscopio con iluminación infrarroja y los convertidores de la imagen.
20. Retire la córnea y el cristalino. Eliminar la mayor cantidad de vítreo como sea posible.
21. Para grabar cono M-respuestas, eliminar la parte ventral de la ojera ⁴ con una cuchilla de afeitar a juzgar por la marca de la cauterización.
22. Pelar la retina de la capa de epitelio pigmentario.
23. Aplanar la retina y lo coloca en la parte inferior de la placa de Petri llenas de 1.2 ml solución de referencia.
24. Cortar la retina en pequeños trozos delgados con una cuchilla de afeitar y se incuba la preparación en una caja a prueba de luz saturada con oxígeno puro.

Grabaciones

25. Apague el calentador de forma temporal. Cambiar el flujo de perfusión a una tubería de derivación para evitar que la cámara de secado.
26. Drenan la mayor parte de la solución en la cámara usando un pedazo de tejido Kimwipe. Transferir la suspensión de la retina a la cámara de grabación con una pipeta de vidrio.
27. Espere unos 2 minutos hasta que las rodajas de retina se establecen. Interruptor de la perfusión de nuevo. Encender el calefactor.
28. Activar la iluminación infrarroja para visualizar la preparación. Búsqueda de un pedazo de retina tendido en la cámara con segmentos fotorreceptor exterior sobresaliendo (ver figura ejemplo). Dibuja los segmentos internos suavemente en el electrodo por la succión. En esta configuración, varios núcleos y segmentos internos debe ser elaborado en el electrodo. Registrar la photoresponse un destello brillante para probar si un segmento de cono interno está en el electrodo de la célula y si es curartu, a juzgar por la cinética de la respuesta y la amplitud.
29. Inferior del depósito mineral para aplicar una ligera presión negativa a la punta del electrodo para ayudar a sostener el segmento de interior en el electrodo.
30. Registro de flash de prueba, las respuestas de atenuar la intensidad luminosa vez que una célula se encuentra bien. Destellos de prueba son siempre de un estimulador de calibrado óptico de ^5. La intensidad del flash y la longitud de onda son controlados por un conjunto de filtros de densidad neutra y filtros de interferencia de banda estrecha, respectivamente. Prueba de Flash duración (20 ms) es controlado por ordenador basada persianas.

Soluciones

1. Ratón solución de perfusión: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na succinato, 0,5 mM Na glutamato, 0,02 mM EDTA, y 10 mM de glucosa.
2. Grabación del ratón electrodo solución: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.

Discussion

Una sola célula de grabación de aspiración de las células fotorreceptoras se desarrolló hace 3 décadas. Que nos permite grabar través de la membrana cambio de corriente inducida por la estimulación de la luz, sin penetrar la membrana celular. Debido a la alta adhesión célula-célula, es difícil aislar la barra saludable único y el cono de la retina del ratón, como la retina de anfibios y es difícil de encontrar conos individuales debido al bajo porcentaje (3%) y pequeño tamaño. El segmento de interior-en-(IS-in) método de grabación supera esta dificultad mediante el registro actual de los segmentos internos de los fotorreceptores de varios, entre los que podría ser un cono incluidos. En el ratón de tipo salvaje, la respuesta debe ser la combinación de conos y bastones. A la luz de fondo constante se puede utilizar para suprimir las respuestas varilla. En este vídeo, se utilizó Tα-/ - retina, en el que las barras no pueden responder a estimulación de la luz, ya que carecen de la α-subunidad de la proteína-G transducina ^6. Por lo tanto, el photoresponse es sólo de los conos.