Summary
Vi kommer att visa hur man kan spela flash svar från enstaka mus kottar med hjälp av en sug-elektrod.
Abstract
Rod och kon fotoreceptorer i näthinnan är ansvariga för detektering av ljus. I mörker, cyklisk nukleotid-medierade (CNG) kanaler i det yttre segmentet är öppna och tillåter katjoner flöda stadigt inåt över membranet, depolariserande cellen. Ljusexponering utlöser stängningen av CNG-kanaler, kvarter för aktiv ning ström, och därmed resulterar i cell hyperpolarisering. Baserat på polaritet fotoreceptorer, var ett sug inspelning metod som utvecklats på 1970-talet att till skillnad från den klassiska patch-clamp teknik, kräver inte att tränga in i plasmamembranet
Protocol
Göra elektroder
- Gör inspelningen elektroderna med en mikropipett avdragare och polera elektroderna med värme glödtråd i mikroskop. För musen kon encelliga sug inspelning är innerdiametern på elektroden tips om 6-7 ìm.
- Förbered referens elektroder. Väg 1% agar i destillerat vatten. Smält agar lösningen i hett vattenbad. Fyll glaspipetter (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) med 1% agar med spruta. Stelna agarn vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Skär pipetterna i två halvor med en diamant kniv.
- Blötlägg referenselektroder i referens-lösning under minst 24 timmar vid 4 ° C.
Ställa in experimentet
- Mörk anpassa en mus i en svart bur över natten.
- Bereda 100 ml referens och 1 L perfusion lösning (se nedan) och filtrera lösningen.
- Lös upp 0,1% BSA och 10 mM glukos i 20 ml referens lösning.
- Kalibrera ljusintensiteten på den optiska stimulatorn med fotometer.
- Montera inspelning kammare på scenen av den inverterade mikroskopet.
- Bubble perfusionen lösning med 95% O 2 / 5% CO 2, inkubera den i 40 ° C vattenbad för att öka lösligheten av CO 2. Lösningen flöden från flaskan till inspelningen kammare som passerar genom ett keramiskt motstånd uppvärmning till 36-38 ° C. Värmaren bör placeras så nära inspelningen kammaren som möjligt, helst i det skede av mikroskopet.
- Justera flödet regulator för ett flöde på ca 1-1,5 ml / min.
- Fyll inspelningen elektroden med hänvisning lösning. Sätt in elektroden i en elektrod hållaren. Se till att det inte finns några bubblor i elektroden. Montera hållaren på headstage på förstärkaren. Koppla hållaren till en suganordning, som är byggt genom att ansluta slangar delvis fyllda med mineralolja vid sidan-porten på elektrodhållare. Den andra änden av slangen är ansluten till ett litet förråd av mineralolja, som trycket kan tillämpas av munnen.
- Anslut referenselektrod till den andra polen på headstage. Bind den termiska par (TC) till referenselektrod. Se till att elektroden och TC tips är nära varandra så att den uppmätta temperaturen tas så nära cellen som möjligt.
- Slå på IR-belysning för att visualisera elektroden. Elektroden ses av infraröd kamera som är ansluten till en monitor. Center elektroden bilden på synfält och på skärmen med en mikro-manipulator.
- Justera placeringen av referenselektrod spetsen nära (2-4 mm) på inspelningen elektroden spetsen.
- Justera DC-spänning för aggregatet så att temperaturen på lösningen är ca 36-38 ° C.
- Kör ett sigill för att kontrollera motstånd inspelning elektrod, normalt cirka 900 kohm.
Isolera musen näthinnan
- Enligt svagt rött ljus, euthanize den mörka anpassade mus med CO 2 och halsdislokation. Markera ögonglober hjälp av spetsen på en het metall fackla med etsande den mest dorsala punkten i sklera något. Enucleate ögonglober med sax. Alla efterföljande procedurer utförs under infrarött ljus.
- Hemisect ögonglober under mikroskop med infraröd belysning och omvandlare bild.
- Ta bort hornhinnan och linsen. Ta bort så mycket av glaskroppen som möjligt.
- För att spela in M-kon svar, ta bort den ventrala delen av ögonmusslan 4 med ett rakblad döma av diatermi märket.
- Skala näthinnan från pigmentepitel lagret.
- Platta näthinnan och placera det på botten av petriskålen fylld med 1-2 ml referens lösning.
- Skiva näthinnan i små tunna bitar med hjälp av ett rakblad och inkubera preparatet i en ljus-tight box mättad med rent syre.
Inspelningar
- Stäng av värmaren tillfälligt. Växla perfusionen flöde till en bypass slang för att förhindra kammaren från att torka.
- Töm flesta av lösningen i kammaren med en bit Kimwipe vävnad. Överför näthinnan fjädring till inspelningen kammaren med hjälp av ett glas pipett.
- Vänta i ca 2 minuter tills näthinnan skivor lugna ner. Slå på perfusionen igen. Sätt på värmaren.
- Slå på IR-belysning för att visualisera beredningen. Sök efter en bit av näthinnan ligger på kammaren med ljusmätare yttre segment som sticker ut (se exempel figur). Rita inre segmenten försiktigt in i elektroden genom undertryck. I denna konfiguration bör flera kärnor och inre segmenten dras in i elektroden. Anteckna photoresponse till en ljus blinka för att testa om en kon inre segment i elektroden och om cellen läkaThy, att döma av svaret kinetik och amplitud.
- Sänk mineral reservoaren att tillämpa lätt undertryck till spetsen på elektroden för att hålla det inre segmentet i elektroden.
- Spela test-flash svar från svagt till starkt intensitet gång en bra cellen hittas. Testa blinkar tillhandahålls från en kalibrerad optisk stimulator 5. Flash intensitet och våglängd styrs av en uppsättning neutral densitet filter och smalt band filter störningar, respektive. Test flash varaktighet (20 ms) styrs av datorstyrd fönsterluckor.
Lösningar
- Mus perfusion lösning: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mm HEPES (pH 7,4), 20 mm NaHCO 3, 3 mm Na succinat, 0,5 mM Na glutamat, 0,02 mM EDTA och 10 mM glukos.
- Mus inspelning elektrod lösning: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mm HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Encelliga sug inspelning från ljusmätare celler utvecklades tre decennier sedan. Det ger oss möjlighet att spela in trans-membran aktuella förändringar framkallade av ljus utan att tränga igenom cellmembranet. På grund av hög cell-cell adhesion, är det svårt att isolera friska enda tappar och stavar från mus näthinnan som amfibie näthinnan och det är svårt att hitta individuella kottar på grund av den låga andelen (3%) och liten storlek. Den inre etapper-i (IS-in) inspelningsmetod övervinner detta problem genom att spela in ström från de inre delarna av flera fotoreceptorer, bland vilka en kotte kan ingå. I vildtyp mus, bör svaret kunna vara en kombination av stavar och koner. En stadig bakgrundsbelysning kan användas för att undertrycka spö svar. I den här filmen använde vi Tα-/ - näthinnan, där stavar kan inte svara på ljus stimulans, eftersom de saknar α-subenheten av G-protein transducin 6. Därför är photoresponse endast från kottar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av Career Development Award från Forskning kring att förebygga blindhet, NIH bevilja EY 019.312, och fritt anslag från Forskning kring att förebygga blindhet och EY 02.687 (Ögonkliniken och Visual Sciences vid Washington University).
References
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S. Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms. J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation. J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).
