Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.
In tutti i mammiferi, l'epitelio sensoriale per audizione si trova lungo l'organo spirale del Corti che risiede all'interno della coclea conchiglia a forma dell'orecchio interno (fig. 1). Cellule ciliate della coclea sviluppo, che sono le cellule mechanosensory del sistema uditivo, sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre (nella base e la metà di giri) a quattro (nel giro apicale) file di cellule ciliate esterne che abbracciano la lunghezza del dell'organo del Corti. Cellule ciliate trasdurre vibrazioni meccaniche suono indotto della membrana basilare in impulsi nervosi che il cervello può interpretare. La maggior parte dei casi di sordità neurosensoriale sono causati dalla morte o la disfunzione delle cellule ciliate cocleari.
Uno strumento sempre più essenziale nella ricerca uditiva è l'isolamento e la coltura in vitro di espianti di organi 1,2,9. Una volta isolato, il espianti possono essere utilizzati in diversi modi per fornire informazioni riguardanti normative, anomalo, o fisiologia terapeutico. Espressione genica, la motilità stereociglia, biologia cellulare e molecolare, nonché approcci biologici per la rigenerazione delle cellule dei capelli sono esempi di applicazioni sperimentali di organo del Corti espianti.
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo del Corti da topi neonati. Il video che accompagna include le direzioni a tappe per l'isolamento dell'osso temporale da cuccioli mouse e successivo isolamento della coclea, legamento spirale, e organo di Corti. Una volta isolata, l'epitelio sensoriale può essere placcato e coltivate in vitro nella sua interezza, o come un ulteriore sezionato micro-isola che manca la spirale limbo e dei neuroni del ganglio spirale. Usando questo metodo, gli espianti primari può essere mantenuta per 7-10 giorni. Come esempio dell'utilità di questa procedura, organo del Corti espianti sarà elettroporate con un gene esogeno giornalista DsRed. Questo metodo fornisce un miglioramento rispetto ad altri metodi pubblicato in quanto fornisce indicazioni riproducibile, senza ambiguità e graduale per l'isolamento, microdissezione, e la cultura primaria dell'organo del Corti.
Ci sono molti dettagli che sono fondamentali per il successo di questa procedura. Minore è il tempo dall'isolamento osso temporale per organo di incubazione Corti, maggiore è la possibilità che gli organi che attribuirà alla coprioggetto e risultato nelle culture degli organi vitali. Pertanto, è importante limitare la quantità di tempo che intercorre tra la dissezione e l'immissione degli organi nell'incubatrice. La scelta dell'antibiotico è cruciale, dato che molti antibiotici aminoglicosidici sono ototossici e può provocare la morte delle cellule dei capelli. Anche se è preferibile rinunciare all'uso di antibiotici del tutto, questo lascia aperta la possibilità di contaminazione. Pertanto, si consiglia l'uso di 10 mg / ml ampicillina come regola generale per superare problemi di contaminazione potenziale.
L'aspetto più fastidioso di questa, e altre procedure per la coltura primaria dell'organo del Corti, è la tendenza degli organi di galleggiare fuori i piatti durante l'incubazione. Anche se le culture organo galleggiante possono rimanere vitali per 5-7 giorni, ci sono svantaggi di organi coltura galleggiante. Per esempio, culture d'organo galleggiante spesso piega su se stessi dopo 4-5 giorni di rendering microscopia problematico. Successivamente, l'integrità strutturale di un organo può diventare compromessa rispetto agli organi che sono stati apposti i coprioggetto. Abbiamo scoperto che le seguenti tecniche contribuirà ad assicurare che l'organo del Corti non galleggia in terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. In primo luogo, cappotto coprioggetto il vetro in 1:1 polyornithine / laminina integrata con 20% FBS come descritto. La notte di incubazione previsto dal presente protocollo è il tempo minimo che il piatto deve essere rivestita. Nel nostro laboratorio, abbiamo spesso strato tutti i piatti di cui abbiamo bisogno per una settimana e tenerli a 4 ° C fino al giorno prima dell'uso quando li passare al incubatore per una notte di incubazione. In secondo luogo, dopo che gli organi sono trasportati al coprioggetto rivestito, orientare l'espianto in modo che le ciglia delle cellule ciliate a faccia in su. Questo orientamento facilita l'aderenza della membrana basilare per il piatto cultura. In terzo luogo, rimuovere il supporto all'interno del pozzo di apporre l'espianto al piatto rivestito. Questo garantirà il contatto tra il piatto della cultura e della membrana basilare e migliorare la capacità del espianti di aderire al vetro. Ciò contribuirà anche a mantenere l'integrità strutturale del file di cellule ciliate. Infine, attenzione a goccia 2 gocce di terreno di coltura sulla superficie dell'organo del Corti con una pipetta 200 microlitri capacità e poi, lentamente, riempire il pozzo da gocciolamento del volume residuo (del totale 130 mL) sul lato del coprioggetto. E 'importante lavorare rapidamente per assicurare l'attaccamento dell'organo del Corti alla coprioggetto rivestito. Dalla data di apertura della dissezione per l'incubazione del espianti, che in genere dura 10 minuti per un operatore praticato per completare questa procedura di isolamento organo di Corti.
In questo protocollo, si presentano anche un metodo per la micro-isolamento dell'epitelio sensoriale dal limbo spirale dell'organo del Corti. In questa procedura, il limbus spirale è sezionato dalla epitelio sensoriale utilizzando aghi 28G ½ insulina come strumenti di dissezione. La risultante micro-isolare costituito le file di cellule ciliate e le corrispondenti celle di supporto (fig. 3). L'epitelio sensoriale isolato può essere colto come descritto in questo protocollo. Questo micro-isolamento procedura deve essere confrontata con la separazione enzimatica degli epiteli sensoriali dal tessuto circostante 4. Nei mammiferi, così come non-mammiferi specie come polli, digestione thermolysin di isolati risultati vestibolare organi nell'isolamento degli epiteli sensoriali dalle cellule mesenchimali seminterrato 4. Nel ratto coclea, i risultati digestione thermolysin nella separazione della cresta epiteliale maggiore, minore cresta epiteliale e di accompagnamento epiteli sensoriali dalla membrana basale 5. Tuttavia, non è chiaro se l'epitelio sensoriale cocleare possibile allegare alle piastre di rivestimento senza l'accompagnamento delle cellule mesenchimali. Mentre sia la micro-meccanica e di isolamento metodo enzimatico risultato metodo della digestione, la separazione degli epiteli sensoriali dal limbo spirale, i vantaggi della micro-dissezione isolare il digestione thermolysin includere un protocollo relativamente più brevi, meno costosi reagenti, e lo stress potenzialmente meno di l'espianto a causa degli effetti della digestione enzimatica. Inoltre, la membrana basale è lasciata intatta in questo approccio, che può aumentare l'attaccamento dell'epitelio sensoriale alla piastra di coltura. Gli svantaggi di questo metodo comprendono la necessità di sviluppare le competenze di questa delicata dissezione e potenziali danni meccanici per l'epitelio sensoriale derivante dalla dissezione micro.
Come esempio dell'utilità di questa procedura, si presentano anche un esempio dell'uso dell'organo diCulture Corti, l'elettroporazione di geni esogeni nella cultura espianto. La procedura sopra descritta elettroporazione si basa su precedenti metodi di elettroporazione organo del Corti. In particolare, Zheng e Gao (2000) descrivono l'elettroporazione di organi isolati di ratto delle Corti dove si svolgono le espianti in vigore per l'elettroporazione di una scanalatura di costruzione della agarosio e poi placcato sul collagene rivestito 8-scivolo LabTek bene in mezzo privo di siero 2. Un vantaggio di questo approccio è che gli organi sono orientate in modo che la superficie superiore del espianti faccia il catodo, che teoricamente dovrebbe portare a una distribuzione uniforme delle cellule elettroporate attraverso l'espianto. Nelle nostre mani tuttavia, il metodo che descriviamo migliorato su questa procedura perché l'organo del Corti è rimasto apposta sul coprioggetto durante tutta la procedura in modo da ridurre la manipolazione degli espianti dopo l'elettroporazione. Inoltre, una percentuale più alta di organi di Corti rimasta unita al copri con questo metodo presentato. Il nostro metodo è tratto da Jones et al. (2006) che utilizza l'aggiunta della Fugene 6 reagente per aumentare l'efficienza di espressione genica dopo l'elettroporazione. Nel Jones et al. (2006) il protocollo, gli organi sono elettroporate, incubate per 5 minuti con 100 ml di Fugene 6 reagenti di trasfezione, e placcato 6. Il nostro metodo si differenzia per l'uso di un rapporto 3:2 di Fugene 6 reagente al DNA plasmide, che abbiamo trovato empiricamente per fornire ottimale espressione transgenici con minima tossicità d'organo. Non usiamo puro Fugene 6 reagente, il che può causare tossicità per le colture. La configurazione degli elettrodi nel nostro protocollo, così come Jones et al. (2006), si traduce in espressione genica primario sia la spirale limbus o epitelio sensoriale a seconda della posizione del catodo. Anche se ci sono DsRed cellule positive sul versante della cultura distante verso il catodo, vi è una maggiore concentrazione di cellule transgeniche più vicino al catodo. Per assicurare una completa espressione del transgene in entrambi i lati dell'organo del Corti espianto, la corrente può essere invertita per un treno di impulsi secondo semplicemente invertendo i cavi. I risultati presentati in protocollo l'espressione del transgene robusta in tutto l'organo del Corti (fig. 5).
Gli autori desiderano ringraziare Demêmes Danielle e Douglas Cotanche e per il loro impegno nella didattica noi i metodi per l'isolamento di dell'organo del Corti. Inoltre, vorremmo ringraziare Ismaele Stefanov-Wagner per la progettazione degli elettrodi elettroporatore; Sherry Lin per le sue opere d'arte che contribuiscono alla animazione video, e Matteo Chana, Jason Meeker, Kendra e Marshall ( www.goodfightproductions.com ) per la produzione del video. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI supporto di base per Hearing Research) dal dell'NIDCD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
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Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |