Denna procedur beskriver en metod för isolering och odling av murina organ Corti med eller utan spiral limbus och spiral nervceller ganglion. Vi visar också en metod för uttrycket av en exogen reporter gen i det organ i Corti Explantation av elektroporation.
I alla däggdjur, är den sensoriska epitelet för audition längs spiral organ Corti som finns inom conch formade snäckan i innerörat (fig 1). Hårceller i u-snäckan, som är de mechanosensory cellerna i hörselsystemet, justeras på en rad av inre hårceller och tre (i bas och mid-varv) till fyra (i den apikala tur) rader av yttre hårceller som spänner över längden på organ Corti. Hårcellerna transduce ljud-inducerad mekaniska vibrationer i basilarmembranet i neurala impulser som hjärnan kan tolka. De flesta fall av sensorineural hörselnedsättning orsakas av dödsfall eller dysfunktion i cochlea hårceller.
Ett allt viktigare verktyg i hörsel forskning är den isolering och in vitro-kultur av orgeln Explantation 1,2,9. När isolerade, kan explants utnyttjas på flera sätt att ge information om normativt, avvikande eller terapeutiska fysiologi. Genuttryck, sinneshår motilitet, cell-och molekylärbiologi, samt biologiska metoder för håret cellförnyelsen är exempel på experimentella tillämpningar av organ Corti explants.
Detta protokoll beskriver en metod för isolering och odling av organ för Corti från nyfödda möss. Den medföljande videon innehåller stegvisa anvisningar för isolering av tinningbenet från mus ungar, och efterföljande isolering av snäckan, spiralen ligament och organ Corti. När isolerade, kan den sensoriska epitelet beläggas och odlas in vitro i sin helhet, eller som en ytterligare dissekeras mikro-isolera som saknar spiralen limbus och spiral nervceller ganglion. Med denna metod kan primära explants upprätthållas i 7-10 dagar. Som ett exempel på nyttan av detta förfarande kommer organ Corti explants vara electroporated med en exogen DsRed reporter genen. Denna metod ger en förbättring jämfört med andra publicerade metoder för att det ger reproducerbara, entydiga och stegvis anvisningar för isolering, microdissection, och primära kultur organ Corti.
Det finns flera detaljer som är kritiska för att lyckas med detta förfarande. Ju kortare tid från tinningbenet isolering till organ Corti inkubation, desto större chans att organen kommer att lägga till täckglas och resultera i livskraftiga orgel kulturer. Därför är det viktigt att begränsa den tid mellan dissektion och placera organ i inkubatorn. Valet av antibiotika är också avgörande, eftersom många aminoglykosid antibiotika är ototoxiska och kommer att resultera i håret celldöd. Även om det är bättre att avstå från användningen av antibiotika helt lämnar denna öppna möjligheten för kontamination. Därför föreslår vi användning av 10 mikrogram / ml ampicillin som regel att övervinna eventuella föroreningar problem.
Den mest besvärande aspekt av detta, och andra förfaranden för den primära kultur organ Corti, är tendensen hos de organ flyta bort plattorna under inkubationstiden. Även om flytande orgel kulturer kan vara lönsamt för 5-7 dagar, det finns nackdelar med odling flytande organ. Till exempel flytande orgel kulturer ofta lägger på sig själv efter 4-5 dagar rendering mikroskopi problematisk. Därefter kan den strukturella integriteten av orgeln blir äventyras jämfört med organ som har fästs på täckglas. Vi har funnit att följande tekniker bidra till att de organ Corti inte flyta i kultur media, men är fortfarande fäst på täckglas. Först päls glaset täckglas i 1:1 polyornithine / laminin kompletteras med 20% FBS som beskrivs. Den natten inkubation krävs i detta protokoll är den minsta tid att plattan ska vara belagda. I vårt laboratorium, vi ofta päls alla de plattor som vi behöver i en vecka och hålla dem vid 4 ° C tills dagen före att använda när vi flyttar dem till drivhus för en övernattning inkubation. Andra plats, efter de organ transporteras till belagda täckglasen, den Explantation orientera så att flimmerhåren av hårcellerna uppåt. Denna inriktning kommer att underlätta anslutning av basilarmembranet till kulturen skålen. Tredje, ta bort materialet inom väl att anbringa explantation till belagda skålen. Detta kommer att säkerställa kontakt mellan kulturen skålen och basilarmembranet och öka möjligheten för explants att hålla fast vid glaset. Detta kommer också att bidra till att upprätthålla den strukturella integriteten i rader av hårcellerna. Slutligen försiktigt droppa 2 droppar odlingsmedium på ytan av de organ Corti med hjälp av en 200 mikroliter kapacitet pipett och sedan långsamt fylla bra genom att droppa den återstående volymen (av totalt 130 mikroliter) på sidan av täckglas. Det är viktigt att arbeta snabbt för att försäkra att fästa organ Corti till belagda täckglas. Från inledandet av dissekering till inkubering av explants tar det normalt 10 minuter för en van operatör att slutföra detta organ Corti isolering förfarande.
I detta protokoll presenterar vi också en metod för mikro-isolering av sensoriska epitelet från spiral limbus av organ Corti. Vid detta förfarande är spiral limbus dissekerade bort från sensoriska epitelet med hjälp av 28G ½ insulin nålar som dissekering verktyg. Den mikroorganism som isolerar består av rader av hårcellerna och deras motsvarande stödjande celler (bild 3). De isolerade sensoriska epitelet kan sedan odlas som beskrivs i detta protokoll. Denna mikro-isolering förfarande bör jämföras med den enzymatiska separation av sensoriska epitel från omgivande vävnad 4. Hos däggdjur, samt icke-däggdjur såsom kycklingar, thermolysin rötning av isolerade vestibulära organ leder till isolering av sensoriska epitel från källaren mesenkymala celler 4. Hos råtta snäckan, thermolysin matsmältning leder till separation av de större epiteliala åsen, mindre epiteliala ås och medföljande sensoriska epitel från basalmembranet 5. Det är dock oklart om cochlea sensoriska epitelet kan fästa på plåt utan medföljande mesenkymala celler. Medan både den mekaniska mikro-isolering metod och enzymatisk digestionsmetoden leda till separation av de sensoriska epitel från spiralen limbus, fördelarna med mikro-isolera dissektion över thermolysin matsmältningen inkluderar en relativt kortare protokoll, billigare reagens och potentiellt mindre stress den Explantation grund av enzymatiska effekter av matsmältningen. Dessutom är basalmembranet kvar intakt i denna strategi, som kan öka fastsättning av sensoriska epitelet till kulturen plattan. Nackdelar med denna metod är bland annat behovet av att utveckla kompetens för denna känsliga dissektion och potentiella mekaniska skador på sensoriska epitelet till följd av mikro dissekering.
Som ett exempel på nyttan av detta förfarande, presenterar vi också ett exempel på användning av organCorti kulturer, den elektroporering av exogena gener i Explantation kulturen. Det elektroporation förfarande som beskrivs ovan är baserad på tidigare metoder för organ Corti elektroporation. Särskilt Zheng och Gao (2000) beskriver elektroporering av isolerade råtta organ Corti där explants hålls på plats för elektroporering av en gjuten spåret agaros och sedan pläterade på kollagen bestruket 8-brunnars LabTek bild i serumfritt medelstora 2. En fördel med deras metod är att de organ är orienterade så att den övre ytorna på explants ansiktet katoden, vilket teoretiskt sett bör resultera i en jämn fördelning av electroporated celler inom hela Explantation. I våra händer dock den metod som vi beskriver förbättrats på detta förfarande eftersom det organ Corti återstod fäst på täckglas under hela förfarandet därigenom minska manipulation av Explantation efter elektroporation. Dessutom återstod en högre andel av organ Corti knutna till täckglas med denna presenteras metoden. Vår metod är hämtad från Jones, et al. (2006) som använder tillägget av Fugene 6 reagens för att öka effektiviteten av genuttryck efter elektroporation. I Jones et al. (2006) protokoll, är de organ electroporated, ruvade i 5 minuter med 100 mikroliter av Fugene 6 transfektion reagens, och pläterade 6. Vår metod skiljer sig i användandet av en 3:2 förhållande Fugene 6 reagens plasmid-DNA, som vi funnit empiriskt för att ge optimal transgena uttrycket med minimal organtoxicitet. Vi använder inte outspädd Fugene 6 reagens, vilket kan resultera i toxicitet för de kulturer. Den elektrod konfiguration i våra protokoll, samt Jones et al. (2006), resulterar i primära genuttryck i antingen spiral limbus eller sensoriska epitelet beroende på position katod. Även om det finns DsRed positiva celler på sidan av den kultur fjärran till katoden, det finns en högre koncentration av transgena celler närmare katoden. För att säkerställa ett fullständigt uttryck för transgenen på båda sidor av organ Corti Explantation, kan den nuvarande vändas för en andra pulståg genom att helt enkelt vända leder. De presenterade protokollet ger robust uttryck för transgenen hela organ Corti (fig 5).
Författarna vill tacka Demêmes Danielle och Douglas Cotanche och för deras insatser i undervisningen oss metoder för isolering av organ Corti. Dessutom skulle vi vilja tacka Ismael Stefanov-Wagner för konstruktion av electroporator elektroderna, Sherry Lin för henne bidrar till grafiken i videon animation, och Matthew Chana, Jason Meeker och Kendra Marshall ( www.goodfightproductions.com ) för att producera videon. Detta arbete har finansierats av bidrag (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge, P30DC05209-MEEI Core Support för hörsel-forskning) från NIDCD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
|
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |