प्राथमिक संस्कृति और Corti के murine अंग के प्लाज्मिड electroporation.
Summary
इस प्रक्रिया के साथ या बिना सर्पिल किनारी और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स Corti के murine अंग के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हम भी electroporation द्वारा Corti explant के अंग में एक exogenous रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का प्रदर्शन.
Abstract
सभी स्तनधारियों में ऑडिशन के लिए संवेदी उपकला Corti के बढ़ते अंग है कि भीतरी कान (अंजीर 1) के शंख आकार कोक्लीअ के भीतर रहता है के साथ स्थित है. विकासशील कोक्लीअ, जो श्रवण प्रणाली की mechanosensory कोशिकाओं में बालों की कोशिकाओं के भीतर बालों की कोशिकाओं की एक पंक्ति और तीन आधार और मध्य मुड़ता में से चार (शिखर बारी में) बाहरी बालों की कोशिकाओं की पंक्तियों में जुड़ रहे हैं कि Corti के अंग की लंबाई अवधि. बालों की कोशिकाओं तंत्रिका आवेगों है कि मस्तिष्क की व्याख्या कर सकते हैं में आधारी झिल्ली की ध्वनि प्रेरित कंपन यांत्रिक transduce. Sensorineural सुनवाई हानि के अधिकांश मामलों में या cochlear बालों की कोशिकाओं की मौत में शिथिलता के कारण कर रहे हैं.
श्रवण अनुसंधान के क्षेत्र में एक तेजी से आवश्यक उपकरण अलगाव है और अंग 1,2,9 explant के इन विट्रो संस्कृति में . एक बार अलग, explants मानक के बारे में जानकारी, विषम, या चिकित्सकीय फिजियोलॉजी प्रदान करने के कई तरीके में उपयोग किया जा सकता है. जीन अभिव्यक्ति, stereocilia गतिशीलता सेल और आण्विक जीव विज्ञान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाल सेल पुनर्जनन के लिए जैविक दृष्टिकोण Corti explants के अंग के प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के उदाहरण हैं.
इस प्रोटोकॉल और नवजात चूहों से Corti के अंग के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है. साथ वीडियो माउस पिल्ले से अस्थायी हड्डी के अलगाव के लिए stepwise दिशाओं, और कोक्लीअ, सर्पिल, बंधन, और Corti के अंग के बाद अलगाव भी शामिल है. एक बार अलग संवेदी उपकला और मढ़वाया जा सकता है अपनी संपूर्णता में इन विट्रो में सुसंस्कृत, या के रूप में एक आगे dissected सूक्ष्म अलग है कि सर्पिल किनारी और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स का अभाव है. इस पद्धति का उपयोग करके, प्राथमिक explants 7-10 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है. इस प्रक्रिया की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में, Corti explants के अंग एक exogenous DsRed रिपोर्टर जीन के साथ electroporated जाएगा. इस विधि के अन्य तरीकों पर प्रकाशित एक सुधार प्रदान करता है क्योंकि यह अलगाव, microdissection, और Corti के अंग के प्राथमिक संस्कृति के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्पष्ट, और stepwise निर्देश प्रदान करता है है.
Protocol
Discussion
वहाँ कई जानकारी है कि इस प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कर रहे हैं. टेम्पोरल हड्डी अलगाव से कम Corti ऊष्मायन, अधिक से अधिक मौका है कि अंगों coverslip और व्यवहार्य अंग संस्कृतियों में परिणाम देते हैं जाएगा के अंग के लिए समय है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है विच्छेदन और इन्क्यूबेटर में रखने के अंगों के बीच समय की राशि की सीमा. एंटीबायोटिक का चुनाव भी महत्वपूर्ण है, के बाद से कई aminoglycoside एंटीबायोटिक दवाओं ototoxic हैं और बाल कोशिका मृत्यु में परिणाम देगा. हालांकि यह बेहतर है के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग को पूरी तरह छोड़, इस संभावना संदूषण के लिए खुला छोड़ देता है. इसलिए, हम संभावित संदूषण समस्याओं को दूर करने के लिए एक सामान्य नियम के रूप में 10 μg / एमएल एम्पीसिलीन का उपयोग का सुझाव देते हैं.
इस का सबसे परेशानी पहलू है, और Corti के अंग के प्राथमिक संस्कृति लिए अन्य प्रक्रियाओं, अंगों की प्रवृत्ति बंद ऊष्मायन के दौरान प्लेटें नाव है. हालांकि अस्थायी अंग संस्कृतियों 5-7 दिनों के लिए व्यवहार्य रह सकते हैं, वहाँ संवर्धन अस्थायी अंगों की कमियां हैं. उदाहरण के लिए, तैर अंग संस्कृतियों अक्सर माइक्रोस्कोपी समस्याग्रस्त प्रतिपादन 4-5 दिनों के बाद खुद पर गुना. बाद में, जब अंग है कि coverslip चिपका गया है की तुलना में अंग के संरचनात्मक अखंडता समझौता बन सकता है. हमने पाया है कि निम्नलिखित तकनीकों मदद करने के लिए सुनिश्चित करें कि Corti के अंग संस्कृति मीडिया में नाव नहीं करता, लेकिन रहता है coverslip करने के लिए चिपका. सबसे पहले, कोट 01:01 polyornithine / laminin में कांच coverslips 20% के रूप में वर्णित FBS के साथ पूरक है. रातोंरात इस प्रोटोकॉल के लिए बुलाया ऊष्मायन न्यूनतम समय है कि थाली लेपित होना चाहिए है. हमारी प्रयोगशाला में, हम अक्सर कोट प्लेटों है कि हम एक सप्ताह के लिए की जरूरत है और उन्हें 4 बजे रखने के सभी डिग्री सेल्सियस दिन तक पहले जब हम एक रात ऊष्मायन के लिए इनक्यूबेटर के लिए उन्हें स्थानांतरित करने के लिए उपयोग करने के लिए. दूसरा, के बाद अंगों लेपित coverslips जाया जाता है, पूरबी explant इतना है कि बालों की कोशिकाओं की cilia चेहरा. इस उन्मुखीकरण संस्कृति पकवान आधारी झिल्ली के पालन को सुविधा होगी. तीसरा, अच्छी तरह के भीतर मीडिया लेपित पकवान प्रत्यय हटायें explant. यह संस्कृति डिश और आधारी झिल्ली के बीच संपर्क को सुनिश्चित करने और कांच का पालन explants की क्षमता में वृद्धि होगी. यह भी बालों की कोशिकाओं की पंक्तियों के संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में मदद करेंगे. अंत में, ध्यान Corti के अंग एक 200 μL क्षमता पिपेट का उपयोग कर की सतह पर मध्यम संस्कृति के 2 बूँदें ड्रिप और फिर धीरे coverslip के किनारे पर शेष मात्रा (कुल 130 μL के) टपकाव द्वारा अच्छी तरह से भरने. यह महत्वपूर्ण है जल्दी से काम करने के लिए लेपित coverslip Corti के अंग की कुर्की आश्वासन. Explants के ऊष्मायन के लिए विच्छेदन की दीक्षा से, यह आमतौर पर एक अभ्यास ऑपरेटर के लिए 10 मिनट लगते हैं Corti अलगाव प्रक्रिया के इस अंग को पूरा.
इस प्रोटोकॉल में, हम भी सूक्ष्म Corti के अंग के सर्पिल किनारी से संवेदी उपकला के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. इस प्रक्रिया में, सर्पिल किनारी दूर संवेदी 28G का उपयोग उपकला से dissected है आधा विच्छेदन उपकरण के रूप में इंसुलिन सुई. माइक्रो अलग बालों की कोशिकाओं और उनके इसी समर्थन की कोशिकाओं (3 अंजीर) की पंक्तियों के परिणामस्वरूप होते हैं. पृथक संवेदी उपकला तो इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित सभ्य जा सकता है. इस अलगाव सूक्ष्म प्रक्रिया ऊतक आसपास 4 से संवेदी epithelia के enzymatic जुदाई की तुलना में किया जाना चाहिए. स्तनधारियों में, के रूप में अच्छी तरह के रूप में गैर – जैसे मुर्गी, पृथक तहखाने mesenchymal 4 कोशिकाओं से संवेदी epithelia के अलगाव में vestibular अंगों परिणामों के thermolysin पाचन स्तनधारी प्रजातियों. चूहे कोक्लीअ में, thermolysin अधिक से अधिक उपकला रिज के जुदाई, कम उपकला रिज और तहखाने झिल्ली से 5 के साथ संवेदी epithelia में पाचन का परिणाम है. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि cochlear संवेदी उपकला साथ mesenchymal कोशिकाओं के बिना लेपित प्लेटें करने के लिए संलग्न कर सकते हैं. जबकि दोनों यांत्रिक विधि सूक्ष्म अलगाव और सर्पिल किनारी से संवेदी epithelia की जुदाई में enzymatic पाचन विधि परिणाम, thermolysin पाचन अधिक सूक्ष्म अलग विच्छेदन के लाभ एक अपेक्षाकृत कम प्रोटोकॉल, सस्ता अभिकर्मकों, और संभवतः कम तनाव में शामिल पाचन की enzymatic प्रभाव के कारण explant. इसके अतिरिक्त, इस दृष्टिकोण में तहखाने झिल्ली बरकरार रह है, जो संवेदी उपकला की संस्कृति की थाली अनुलग्नक वृद्धि कर सकते हैं. इस विधि का नुकसान इस नाजुक विच्छेदन और संभावित संवेदी सूक्ष्म विच्छेदन से परिणामस्वरूप उपकला यांत्रिक क्षति के लिए कौशल विकसित करने की आवश्यकता शामिल हैं.
इस प्रक्रिया की उपयोगिता का एक उदाहरण के रूप में, हम भी के अंग के उपयोग का एक उदाहरण पेशCorti संस्कृतियों, explant संस्कृति में exogenous जीन की electroporation. electroporation ऊपर वर्णित प्रक्रिया Corti electroporation के अंग के पिछले विधियों पर आधारित है. विशेष रूप से, Zheng और गाओ (2000) Corti के अलग चूहा अंगों जहां explants electroporation के लिए जगह में आयोजित की जाती हैं agarose का एक ढाला नाली के द्वारा और फिर कोलेजन पर लेपित सीरम मुक्त 2 मध्यम में 8 अच्छी तरह LabTek स्लाइड मढ़वाया की electroporation का वर्णन. उनके दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि अंगों को इतनी उन्मुख होते हैं कि explants के शीर्ष सतहों कैथोड, जो सैद्धांतिक रूप से explant भर electroporated कोशिकाओं की एक भी वितरण में परिणाम चाहिए का सामना है. लेकिन हमारे हाथ में, विधि है कि हम इस प्रक्रिया का वर्णन पर सुधार क्योंकि Corti के अंग प्रक्रिया के दौरान coverslip करने के लिए चिपका रहे जिससे electroporation बाद explant के हेरफेर को कम करने. इसके अतिरिक्त, Corti के अंगों के एक उच्च प्रतिशत इस प्रस्तुत पद्धति का उपयोग करके coverslips से जुड़ी बने रहे. हमारी विधि जोन्स, एट अल (2006) जो Fugene 6 अभिकर्मक के अलावा electroporation के बाद जीन अभिव्यक्ति की दक्षता बढ़ाने के लिए उपयोग करता है से लिया है. जोन्स एट अल (2006) के प्रोटोकॉल में, अंगों electroporated Fugene 6 अभिकर्मक अभिकर्मक के 100 μL, और 6 मढ़वाया के साथ 5 मिनट के लिए incubated. हमारी विधि Fugene 6 अभिकर्मक 03:02 प्लास्मिड डीएनए है, जो हम empirically पाया न्यूनतम अंग विषाक्तता के साथ इष्टतम ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए अनुपात का उपयोग में अलग है. हम undiluted Fugene 6 अभिकर्मक का उपयोग नहीं, जो संस्कृतियों के लिए विषाक्तता में परिणाम कर सकते हैं. हमारे प्रोटोकॉल में इलेक्ट्रोड विन्यास, के रूप में के रूप में अच्छी तरह जोन्स एट अल (2006) या तो सर्पिल किनारी या संवेदी कैथोड की स्थिति पर निर्भर करता है उपकला में प्राथमिक जीन अभिव्यक्ति में, परिणाम है. यद्यपि वहाँ कैथोड दूर संस्कृति की तरफ DsRed सकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं, वहाँ ट्रांसजेनिक कोशिकाओं के एक उच्च कैथोड को करीब एकाग्रता है. Corti explant के अंग के दोनों पक्षों में transgene की एक पूरी अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, वर्तमान बस inverting सुराग के द्वारा एक दूसरे पल्स ट्रेन के लिए उलट किया जा सकता है. प्रस्तुत Corti (अंजीर 5) के अंग भर transgene मजबूत अभिव्यक्ति में प्रोटोकॉल का परिणाम है.
Acknowledgements
लेखकों के लिए Demêmes डेनिएल और डगलस Cotanche शुक्रिया अदा करना है और हमें Corti के अंग के अलगाव के लिए शिक्षण विधियों में उनके प्रयासों के लिए होगा. और मैथ्यू चना, जेसन Meeker, केन्द्र और मार्शल (शेरी लिन, उसके योगदान वीडियो एनीमेशन के लिए कलाकृति के लिए, इसके अतिरिक्त, हम इश्माएल electroporator इलेक्ट्रोड Stefanov – वैगनर इंजीनियरिंग के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं www.goodfightproductions.com वीडियो उत्पादन के लिए ). NIDCD से इस काम अनुदान (P30DC05209 MEEI रिसर्च सुनवाई के लिए कोर समर्थन; RO1DC007174 एज R03DC010065 पार्कर) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
| Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
| #11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
| Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
|
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
| Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
| Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
References
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