Cerebral blodets syresättning Mätning baseras på syre-beroende härdning av Fosforescens

Summary

Vi presenterar en experimentell metoder för att mäta partialtrycket av syre (PO2) i hjärnans kärlsystem baseras på syre-beroende härdning av fosforescens. Animal förberedelser och procedurer bildhantering angavs för både stora synfält CCD-baserad avbildning av pO2 på råttor och 2-photon excitation baserad avbildning av pO2 i möss.

Abstract

Övervakning av Spatiotemporal egenskaper cerebral blod och vävnad syresättning är avgörande för ökad förståelse för neuro-metabola-vaskulära relation. Utveckling av nya pO2 mätning former med samtidig övervakning av pO2 i större synfält med högre rumslig och / eller tidsmässig kommer att ge större insikt i hur hjärnans normala och kommer också att ha stor inverkan på diagnostik och behandling av neurovaskulära sjukdomar som stroke, Alzheimers sjukdom, och skallskada.

Optisk avbildningsmetoder har visat en stor potential att ge hög Spatiotemporal upplösning och kvantitativ avbildning av pO2 baserade på hemoglobin absorption i synliga och nära infraröda området av optiska spektrum. Baseras dock multispektrala mätningar av cerebral blodets syresättning på fotonen invandring genom starkt spridande hjärnvävnaden. Uppskattning och modellering av vävnad optiska parametrar, som kan genomgå dynamiska förändringar under försöket, vanligen krävs för korrekt uppskattning av blodets syresättning. Å andra sidan bör uppskattning av partialtrycket av syre (PO2) baserad på syre-beroende härdning av fosforescens inte nämnvärt påverkas av förändringar i den optiska parametrar i vävnaden och ger ett absolut mått på pO2. Experimentella system som använder syrekänsliga färgämnen har påvisats i in vivo-studier av perfusion vävnaden samt för övervakning av syrehalten i vävnadskultur, som visar att fosforescens släcka är en potent teknik som kan exakt syre imaging i den fysiologiska pO2 sortiment.

Här visar vi med två olika avbildningsmetoder hur du kan utföra mätning av pO2 i kortikala kärlsystem baserat på fosforescens livstid avbildning. I första demonstrationen presenterar vi brett synfält avbildning av pO2 i kortikala ytan av en råtta. Denna avbildning modalitet har relativt enkla experiment bygger på en CCD-kamera och en pulsad grön laser. Ett exempel på övervakning av hjärnbarken sprider depression baseras på fosforescens livslängd Oxyphor R3 färg presenterades. På andra demonstrationen presenterar vi en hög upplösning två-photon pO2 avbildning i kortikala mikro-kärlsystem av en mus. Den experimentuppställning ingår en specialbyggd två-photon mikroskop med femtosecond laser, elektro-optisk modulator, och fotonräknande foto multiplikator rör. Vi presenterar ett exempel på avbildning PO2 heterogenitet i kortikala mikrocirkulation inklusive blodkärl, enligt en ny PTP-C343 färg med förbättrad 2-photon excitation tvärsnitt.

Klicka här för att se relaterade artikeln Syntes och kalibrering av Phosphorescent Nanoprobes för Oxygen Imaging i biologiska system.

Protocol

1. Brett synfält avbildning av pO2 i kortikala kärlsystem av en råtta

1. Råttor (250 g -350 g) initialt sövda med isofluran, och femoral artär och ven är kateter för att övervaka hjärtfrekvens, blodtryck, och gaser blod, liksom för intravenös infusion. Kroppstemperaturen hålls vid 37 ± 0,1 ° C. Trakeotomi utförs, och råttor är ventilerade med en blandning av luft och syre.
2. Blodprov för mätning av blodgaser tas varje 30-45 min och ventilation och anestesi är anpassade för att hålla blodgaser inom normala fysiologiska intervall.
3. En stängd kraniell fönster på parietala ben 4 mm x 4 mm i storlek är förberedd för avbildning. Benet och dura tas bort och kraniala fönstret är fyllda med 1,5% agaros och förseglas med ett mikroskop täckglas. En ytterligare 1 mm ² grader hål på den främre benet används för att framkalla CSD av intracortical mikroinjektion av KCl (~ 10 l, 1 M). Extrem försiktighet bör vidtas för att undvika skador i kortikala kärlbädden. Överskott av värme, mekaniskt tryck eller kort period av hypoxi kan äventyra blod-hjärnbarriären och orsaka läckage av färgämnet från kärlsystemet till interstitiella rummet.
4. En mask från optiskt ogenomskinligt material placeras runt kraniell fönster. Syftet med masken är att absorbera fosforescens signal som kommer från färgämne som läckt in i vävnad från kanterna av dura ärendet. Färgämnet i interstitiell rymden är källan till mycket ljusa fosforescens som kan förstöra mätningen. Den ökade ljusstyrka färg i interstitiell rymden är resultatet av ansamling av färgen i miljö med låg syrehalt tryck och låg härdning takt. Skadan av kärlsystemet i experimentet är därför lätt igen på utseende ljusa fosforescens fläckar, i vilket fall de experimentella uppgifterna förkastas.
5. Efter avslutad operation, är isofluran avbrytas och anestesi är inställd på alfakloralos (50 mg / kg intravenös bolus följt av 40 mg / (kg h) infusion).
6. Animal överförs på en vagn med fläkt, blodtryck och temperatur monitor. Medan andas luften i rummet, är djuret snabbt flyttas till avbildning setup och anbringas på nytt till flödesmätaren med lämplig blandning av luft och syre.
7. Den stereotaxic ram som håller djuret placeras under målet. Den kraniala fönstret är centrerad i synfältet under målet och placeras parallellt med fokalplanet.
8. Den pulsad laser är påslagen och inställd på minimal pulsenergi. Den optiska strålen är riktad mot pulsenergi meter och pulsenergi levereras till provet justeras för att inte vara mer än 10 mJ / cm ^2. Strålen ISS centrerat på kraniella fönstret med snedställda infallsvinkeln på ~ 60 grader och laser ISS avstängd.
9. Blodgas mätningar och justeringar av ventilationen och anestesi sker tills alla fysiologiska parametrar av djuret låg inom normala fysiologiska intervall.
10. Förutsatt att blodvolymen är ca 7% av kroppsvikten, ett anslag från fosforescens sonden Oxyphor R3 är upplöst i 1 ml koksaltlösning för att uppnå 4 x 10 ^-5 koncentration M blod av sonden. Sonden Lösningen injiceras via femorala ven.
11. En 1 M lösning av kaliumklorid är beredd och ~ 1 ul injiceras med sprutan genom burr hålet på pannbenet att inducera CSD.
12. Lasern är påslagen och bildbehandling startas omedelbart efter injektion av KCl-lösning. Avbildning av fosforescens utförs under ~ 10 min.
13. Ett annat blodgas Mätningen utförs för att bekräfta att djuret fysiologiska parametrar är fortfarande inom normalområdet.
14. Fosforescens livslängd erhålls för alla pixlar genom att montera den enda exponentiellt avtagande med olinjära torget montering med statistisk viktning i Matlab. Fosforescens livstid omvandlas till PO2 värden med hjälp av en empirisk Stern Volmer-liknande förhållande (vide infra).

2. Högupplöst två-photon pO2 avbildning i kortikala mikro-kärlsystem med musen

1. Möss är bedövas med isofluorene och femoralisartären kateter för att övervaka hjärtfrekvens, blodtryck, och gaser blod, liksom för administrationen av färgen. Kroppstemperaturen hålls vid 37 ± 0,1 ° C och djur är spontanandning en blandning av luft och syre.
2. En kraniell fönster är upprättad enligt teknik som ursprungligen utvecklades av David Kleinfeld och Winfried Denk. En god vård bör vidtas för att undvika skador på kärlsystemet att förhindra läckage av färgämnet i interstitiell rymden.
3. Några blodprov för mätning av blodgaser tas under en hel beredningen och ventilation och anestesi är anpassade för att hålla blodgases inom normala fysiologiska intervall.
4. Djuret flyttas till avbildning installationen. En modifierad stereotaxic ram som håller djuret placeras under målet. Den kraniala fönstret är centrerad i synfältet enligt Olympus 4X målet och placeras parallellt med fokalplanet.
5. En bild av kraniala fönstret är tagna med digitalkamera genom okularen och 4X målet ersätts med Olympus 20X objektiv (NA = 0,95).
6. Blodgas mätningar och justeringar av ventilationen och anestesi sker tills alla fysiologiska parametrar av djuret inom normala fysiologiska intervall.
7. Förutsatt att blodvolymen är ca 7% av kroppsvikten, ett anslag från fosforescens sonden PTP-C343 är löst i 0,2 ml koksaltlösning för att nå ~ 15 koncentration mikroM blod av sonden. Sonden Lösningen injiceras via lårbensartären.
8. Börja experimentet genom att ställa in önskad tidsintervall för färgerier excitation och emission samling på varje pixel.
9. Skaffa en undersökning skanning vilket är en långsam 2-dimensionell rasterscan av fosforescens intensitet förfall som visar kärlsystemet strukturen på nuvarande djup. Målet flyttas vinkelrätt mot kraniell fönster (Z-axel) och långsam 2D ​​undersökning genomsökningar av fosforescens intensitet tas med hjälp av minimal laser effekt vid 840 nm för att hitta den mikrokärl i bildbehandling planet.
10. Vid varje avbildning djup, baserat på undersökningen genomsökning av fosforescens på detta djup, är en uppsättning punkter inom kärlsystemet valt, och registrering av fosforescens sönderfall vid varje punkt upprepas för ett förutbestämt antal genomsnitt.
11. Ställ in önskad mängd i genomsnitt, mätning intervall, och experimentera varaktighet och starta mätningen. PO ₂ mätningar förvärvas på utvalda platser vid den angivna mätintervallet under hela experimentet.
12. Under mätningarna programvaran åter leder excitation laser för att de valda platserna genom att ändra positionen för speglar galvanometer skanning. Kontroll av galvanometer skannrar, elektrooptiska modulator, och all annan utrustning utförs av skräddarsydda program i LabVIEW.
13. Fosforescens livslängd erhålls för alla valda punkter genom att montera den enda exponentiellt avtagande med olinjära torget montering i Matlab. Fosforescens livstid omvandlas till PO2 värden med hjälp av en empirisk Stern Volmer-liknande förhållande (vide infra).
14. Efter att samla in uppgifterna på olika kortikala djup, injicera dextran-konjugerade fluorescein färgämnet i kärlen för avbildning av mikrocirkulation struktur.
15. Skaffa en bunt med strukturella bilder av kärlsystemet genom att utföra två-photon avbildning av FITC-fluorescens med hjälp av en grön kanal i fyra kanaler detektor.
16. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Massachusetts General Hospital underutskottet för forskning Animal Care.

3. Representativa resultat:

Figur 1. Panel (a) på vänster sida av denna siffra visar ett brett synfält bild av syre trycket före ankomsten av en CSD våg. Panel (b) på höger sida visar de tidsmässiga utvecklingen av det genomsnittliga syretrycket under CSD utbredning inom regionen av intresse märkt på panel (en).

Figur 2 (AVI-film): Denna film visar den tidsmässiga utvecklingen av syretrycket i hela kraniella fönstret vid utbredning av CSD vågen. Skala fältet indikerar syretrycket i millimeter kvicksilver.

Figur 3. 3D-projektion av de avbildade kärlbädden stacken. Den nyanser av grått utgör en volymetrisk fartyg mask, skapas baserat på de strukturella bilden. Uppmätta PO ₂ värden är färgkodade. Skala bar är 200 mikrometer. Återges med tillstånd från Nature Publishing Group. ⁷

Discussion

Vi visade två tillämpningar av pO2 mätningen i kortikala mikrocirkulation baseras på syre-beroende härdning av fosforescens. Den första metoden bygger på CCD-avbildning ger brett synfält övervakning av pO2, mätning partialtrycket av syre i kortikala mikrocirkulation baserat på 2-photon mikroskopi ger kapillär upplösning och medger avbildning på djupet. Båda metoderna ger hög hastighet och högt signal-brus-mätningar. Dessutom är fosforescens livstid mätning av pO2 i stort sett okänsliga för förändringar i de optiska parametrarna i vävnaden under försöket, som vanligtvis är en angelägenhet för andra optiska avbildningstekniker som har en kontrast mekanism som grundas på intensitet. Presenteras instrument möjliggör kvantitativ analys av dynamiska leverans av syre och hjärnvävnaden ämnesomsättningen som leder till en bättre förståelse av neurovaskulär koppling i normal och sjuk hjärna

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glycopyrrolate	Reagent	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.
Lidocaine HCL	Reagent	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Used as the local anesthesia during surgeries.
Isoflurane	Reagent	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.
Alpha Chloralose	Reagent	Sigma-Aldrich	C0128	Used as a general anesthesia during experiments with rats.
Fluorescein isothio-cyanate–dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD2000S	Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.