Medição oxigenação cerebral de sangue baseado em oxigênio-dependente Quenching de fosforescência

Summary

Nós apresentamos um procedimento experimental para medir a pressão parcial de oxigênio (pO2) na vasculatura cerebral com base em oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência. Preparação de animais e procedimentos de imagem foram delineadas para ambos grande campo de visão de imagem CCD-base de pO2 em ratos e dois fótons de imagens de excitação baseada em pO2 em camundongos.

Abstract

Monitoramento das características espaço-temporal do sangue cerebral e oxigenação dos tecidos é fundamental para uma melhor compreensão da relação neuro-vascular-metabólico. Desenvolvimento de novas modalidades pO2 medição com monitoramento simultâneo de pO2 em campos maiores de vista com maior resolução espacial e / ou temporal permitirá um maior conhecimento sobre o funcionamento do cérebro normal e também terá impacto significativo no diagnóstico e tratamento de doenças neurovasculares, tais como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer e traumatismo craniano.

Modalidades de imagem óptica têm demonstrado um grande potencial para fornecer resolução espaço-temporal de imagens de alta e quantitativa de pO2 baseados na absorção de hemoglobina no visível e infravermelho próximo do espectro óptico. Contudo, a medição multiespectrais de oxigenação do sangue cerebral depende de migração de fóton através do tecido dispersores cérebro. Estimativa de parâmetros e modelagem de tecidos ópticos, que podem sofrer mudanças dinâmicas durante o experimento, é normalmente necessária para a estimativa precisa de oxigenação do sangue. Por outro lado, a estimativa da pressão parcial de oxigênio (pO2), com base de oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência não deve ser significativamente afetado pelas mudanças nos parâmetros ópticos do tecido e fornece uma medida absoluta de pO2. Sistemas experimentais que utilizam oxigênio-sensível corantes têm sido demonstrados em estudos in vivo do tecido perfundido, bem como para monitorar o teor de oxigênio em culturas de tecidos, mostrando que quenching fosforescência é uma tecnologia potente capaz de imagem precisa de oxigênio na faixa de pO2 fisiológicas.

Aqui demonstramos com duas diferentes modalidades de imagem como realizar a medição de pO2 na vascularização cortical com base em imagens da vida de fosforescência. Na primeira demonstração apresentamos amplo campo de visão de imagem de pO2 na superfície cortical de um rato. Esta modalidade de imagem tem relativamente simples de configuração experimental baseado em uma câmera CCD e um laser pulsado verde. Um exemplo de monitoramento da depressão alastrante com base em tempo de vida de fosforescência Oxyphor corante R3 foi apresentada. Na segunda demonstração, apresentamos uma alta resolução de dois fótons pO2 imagem em micro vascularização cortical de um mouse. A configuração experimental inclui um costume construída microscópio dois fótons com laser de femtosegundos, eletro-óptica do modulador, e contagem de fótons-tubo multiplicador de fotos. Nós apresentamos um exemplo de imagem a heterogeneidade pO2 na microcirculação cortical incluindo capilares, usando um romance PtP-C343 tintura com maior 2-fótons seção transversal de excitação.

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Protocol

1. Amplo campo de visão de imagem de pO2 na vascularização cortical de um rato

1. Ratos (250 g -350 g) são inicialmente anestesiados com isoflurano, e da artéria femoral e da veia cateterizada são para monitor de freqüência cardíaca, pressão arterial e gases sanguíneos, bem como para perfusão intravenosa. Temperatura corporal é mantida a 37 ± 0,1 ° C. Traqueostomia é realizada, e os ratos são ventilados com uma mistura de ar e oxigênio.
2. Amostras de sangue para medir os gases do sangue são realizadas a cada 30-45 min e ventilação e anestesia são ajustados para manter os gases no sangue dentro de faixa fisiológica normal.
3. A janela fechada do crânio sobre o osso parietal milímetros 4 x 4 mm de tamanho está preparado para a imagem. O osso e dura são removidos ea janela cranial é cheio de agarose 1,5% e selado com uma lamela de microscópio. Um adicional de 1 mm ² orifício de trepanação no osso frontal é usado para induzir CSD por microinjeção intracortical de KCl (~ mL 10, 1 M). Extremo cuidado deve ser tomado para evitar qualquer dano da vasculatura cortical. Excesso de calor, pressão mecânica, ou breve período de hipóxia pode comprometer a barreira hemato-encefálica e causam vazamento do corante da vasculatura para o espaço intersticial.
4. Uma máscara de material opticamente opaco é colocado ao redor janela craniana. O propósito da máscara é para absorver sinal de fosforescência que está vindo do corante que vazou para o tecido a partir das bordas da dura-máter. O corante no espaço intersticial é a fonte da fosforescência muito brilhante que pode estragar a medição. O brilho maior do corante no espaço intersticial é resultado do acúmulo do corante no meio ambiente com baixa pressão de oxigênio e taxa de resfriamento de baixa. Os danos da vasculatura em experimento é, portanto, facilmente reconhecida pelo aparecimento de manchas brilhantes fosforescência, caso em que os dados experimentais é rejeitada.
5. Após o término da cirurgia, o isoflurano é interrompido e anestesia é comutada para alphachloralose (50 mg / kg em bolus seguida de 40 mg / (kg h) infusão).
6. Animal é transferido em um carro com ventilador pressão arterial e controlar a temperatura. Ao respirar o ar ambiente, o animal está rapidamente se mudou para a configuração de imagem e recolocado para o medidor de vazão com a mistura apropriada de ar e oxigênio.
7. A moldura estereotáxica que mantém o animal é colocado no âmbito do objectivo. A janela do crânio está centrada no campo de visão no âmbito do objectivo e posicionado paralelo ao plano focal.
8. O laser pulsado é ligado e definido para a energia mínima do pulso. O feixe óptico é dirigido para pulso medidor de energia e energia de pulso entregue a amostra é ajustado para não ser superior a 10 mJ / cm ^2. O iss feixe centrado na janela cranial com ângulo de incidência oblíqua de ~ 60 graus e iss a laser desligado.
9. Medições dos gases sanguíneos e ajustes da ventilação e anestesia são realizadas até que todos os parâmetros fisiológicos do animal foram dentro da faixa fisiológica normal.
10. Assumindo que o volume de sangue é de aproximadamente 7% do peso corporal, uma quantidade adequada de R3 fosforescência sonda Oxyphor é dissolvido em 1 mL de solução salina para atingir 4 x 10 ^-5 M concentração sanguínea da sonda. A solução da sonda é injetado através da veia femoral.
11. Uma solução 1 M de cloreto de potássio é preparada e ~ ul 1 é injetado com a seringa através do orifício de trepanação no osso frontal para induzir CSD.
12. O laser é ativado e imagem é iniciado imediatamente após a injeção da solução de KCl. Imagem de fosforescência é realizada durante ~ 10 min.
13. Outra medida de gás de sangue é realizada para confirmar que os parâmetros fisiológicos dos animais ainda estão dentro da faixa normal.
14. Vidas fosforescência são obtidos para todos os pixels ajustando o decaimento exponencial simples com encaixe quadrado não-linear com ponderação estatística em Matlab. Vidas fosforescência são convertidos para o pO2 valores usando uma relação empírica Volmer-como Stern (vide infra).

2. Alta resolução de dois fótons pO2 imagem em micro vasculatura cortical de um rato

1. Os ratos são anestesiados com a artéria femoral e isofluorene é cateterizada para monitor de freqüência cardíaca, pressão arterial e gases sanguíneos, bem como para a administração do corante. Temperatura corporal é mantida a 37 ± 0,1 º C e os animais estão respirando espontaneamente uma mistura de ar e oxigênio.
2. Uma janela cranial é preparado de acordo com a técnica desenvolvida originalmente por David Kleinfeld e Winfried Denk. Um cuidado deve ser tomado para evitar qualquer dano da vasculatura para evitar um possível vazamento do corante no espaço intersticial.
3. Algumas amostras de sangue para medir os gases do sangue são tomadas durante um procedimento de preparação toda e ventilação e anestesia são ajustadas para manter o gás de sanguees dentro da faixa fisiológica normal.
4. O animal é movido para a configuração de imagem. Um quadro modificado estereotáxica que mantém o animal é colocado no âmbito do objectivo. A janela do crânio está centrada no campo de visão no âmbito do objectivo Olympus 4X e posicionado paralelo ao plano focal.
5. Uma imagem da janela cranial é tirada com a câmera digital através da ocular, eo objetivo 4X é substituído com o objetivo 20X Olympus (NA = 0,95).
6. Medições dos gases sanguíneos e ajustes da ventilação e anestesia são realizadas até que todos os parâmetros fisiológicos do animal estão dentro de uma faixa fisiológica normal.
7. Assumindo que o volume de sangue é de aproximadamente 7% do peso corporal, uma quantidade adequada de a fosforescência sonda PtP-C343 é dissolvido em 0,2 mL de solução salina para alcançar ~ 15 mM concentração sanguínea da sonda. A solução da sonda é injetado através da artéria femoral.
8. Iniciar o experimento, definindo os intervalos de tempo desejado para a excitação de corante e coleta de emissões em cada pixel.
9. Adquirir uma varredura pesquisa que é uma varredura raster lenta 2-dimensional da deterioração da intensidade de fosforescência que exibe a estrutura vasculatura na profundidade atual. O objetivo é movido perpendicular à janela cranial (eixo Z) e lento scans levantamento 2D de intensidade de fosforescência são tomadas usando a potência do laser mínimo em 840 nm para encontrar os microvasos no plano de imagem.
10. Em cada profundidade de imagem, com base no levantamento de fosforescência scan naquela profundidade, um conjunto de pontos dentro da vasculatura são selecionados, e gravação de cáries fosforescência em cada ponto é repetido para um número predefinido de média.
11. Definir a quantidade desejada de média, intervalo de medição, e duração da experiência e iniciar a medição. pO ₂ medições são adquiridos nos locais selecionados no intervalo de medição especificado para a duração do experimento.
12. Durante as medições, o software re-direciona o laser de excitação para os locais selecionados mudando a posição dos espelhos de varredura galvanômetro. Controle dos scanners galvanômetro, modulador óptico electro, e todos os outros equipamentos são realizados por software feito sob encomenda em LabView.
13. Vidas fosforescência são obtidos para todos os pontos selecionados pelo ajuste do decaimento exponencial simples com encaixe quadrado não-lineares em Matlab. Vidas fosforescência são convertidos para o pO2 valores usando uma relação empírica Volmer-como Stern (vide infra).
14. Depois de coletar os dados em várias profundidades cortical, injetar dextran-conjugado de fluoresceína corante na vasculatura para geração de imagens da estrutura microvasculatura.
15. Obtenção de uma pilha de imagens estruturais da vasculatura executando as imagens de dois fótons de fluorescência FITC usando um canal verde no detector de quatro canais.
16. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Subcomissão Massachusetts General Hospital em Animal Care Research.

3. Resultados representativos:

Painel figura 1. (A) no lado esquerdo desta figura mostra um amplo campo de visão da imagem de pressão de oxigênio antes da chegada de uma onda CSD. Painel (b) do lado direito mostra a evolução temporal da pressão média de oxigênio durante CSD propagação dentro da região de interesse marcada no painel (a).

Figura 2 (avi): Este filme mostra a evolução temporal da pressão de oxigênio em toda a janela do crânio durante a propagação da onda CSD. Barra de escala indica a pressão de oxigênio, em milímetros de mercúrio.

Figura 3. Projeção 3D da pilha vasculatura imagens. Os tons de cinza representam uma máscara navio volumétrico, criado com base na imagem estrutural. Medida pO ₂ valores são codificados por cores. Barra de escala é de 200 micrômetros. Reproduzido com permissão da Nature Publishing Group. ⁷

Discussion

Demonstramos duas aplicações da medição pO2 na microcirculação cortical com base em oxigênio-dependente de têmpera de fosforescência. Enquanto o primeiro método baseado em imagens CCD fornece amplo campo de visão da pO2 monitoramento, medição da pressão parcial de oxigênio na microvasculatura cortical com base em dois fótons de microscopia oferece resolução capilar e permite imagens em profundidade. Ambos os métodos proporcionam alta velocidade e alta relação sinal-ruído das medições. Além disso, a medição do tempo de vida de fosforescência pO2 é em grande medida insensíveis às mudanças nos parâmetros ópticos do tecido durante o experimento, que normalmente é uma preocupação para as outras técnicas de imagem óptico que tem um mecanismo de contraste com base em intensidade. Instrumentos apresentados permitem uma análise quantitativa da dinâmica de entrega de oxigênio e do metabolismo do tecido cerebral que levará a um melhor entendimento do acoplamento neurovascular no cérebro normal e doente

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glycopyrrolate	Reagent	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.
Lidocaine HCL	Reagent	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Used as the local anesthesia during surgeries.
Isoflurane	Reagent	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.
Alpha Chloralose	Reagent	Sigma-Aldrich	C0128	Used as a general anesthesia during experiments with rats.
Fluorescein isothio-cyanate–dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD2000S	Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.