Summary
Vi presentiamo una procedura sperimentale per la misurazione della pressione parziale di ossigeno (pO2) in vasi cerebrali sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Preparazione degli animali e delle procedure di imaging sono stati delineati per entrambi ampio campo visivo CCD-based imaging di pO2 nel ratto e nel 2-fotoni immagini eccitazione base di pO2 nei topi.
Abstract
Monitoraggio delle caratteristiche spazio-temporale di sangue e l'ossigenazione dei tessuti cerebrali è cruciale per una migliore comprensione della neuro-metabolico-vascolari rapporto. Sviluppo di nuove modalità di pO2 misura con il monitoraggio simultaneo di pO2 in grandi campi di vista con maggiore risoluzione spaziale e / o temporale consentirà una maggiore comprensione del funzionamento del cervello normale e avrà anche un impatto significativo sulla diagnosi e cura delle malattie neurovascolari come ictus, il morbo di Alzheimer, e trauma cranico.
Modalità di imaging ottico hanno dimostrato un grande potenziale per fornire ad alta risoluzione spazio-temporali e di imaging quantitativo di pO2 sulla base di assorbimento dell'emoglobina nel visibile e nel vicino campo infrarosso dello spettro ottico. Tuttavia, la misura multispettrali di ossigenazione del sangue cerebrale si basa sulla migrazione fotone attraverso il tessuto cerebrale altamente dispersione. Stima e la modellazione dei parametri dei tessuti ottici, che possono subire cambiamenti dinamici durante l'esperimento, è in genere necessario per la stima accurata di ossigenazione del sangue. D'altra parte, la stima della pressione parziale di ossigeno (pO2) sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza non dovrebbe essere significativamente influenzato dai cambiamenti nei parametri ottica del tessuto e fornisce una misura assoluta di pO2. Sistemi sperimentali che utilizzano ossigeno sensibili coloranti sono stati dimostrati in studi in vivo del tessuto perfusi così come per il monitoraggio del contenuto di ossigeno in colture di tessuti, mostrando che tempra fosforescenza è una potente tecnologia di imaging in grado di ossigeno accurate nel fisiologico pO2 gamma.
Qui mostriamo con due diverse modalità di imaging come eseguire la misurazione di pO2 nel sistema vascolare corticale basata sull'imaging vita fosforescenza. Nella prima dimostrazione che presentiamo ampio campo di vista di immagine pO2 sulla superficie corticale di un topo. Questa modalità di imaging è relativamente semplice apparato sperimentale basato su una camera CCD e un laser pulsato verde. Un esempio di monitoraggio della depressione corticale diffusione sulla base di tutta la vita fosforescenza di colorante R3 Oxyphor è stato presentato. Nella seconda dimostrazione vi presentiamo una risoluzione elevata a due fotoni pO2 immagini in micro vascolarizzazione corticale di un mouse. Il setup sperimentale comprende un personalizzato costruito 2-fotone microscopio con laser a femtosecondi, modulatore elettro-ottico, fotonica e di conteggio tubo moltiplicatore foto. Vi presentiamo un esempio di imaging l'eterogeneità pO2 nel microcircolo corticale tra capillari, con un romanzo PtP-C343 tintura con maggiore 2-fotoni sezione eccitazione.
Clicca qui per visualizzare l'articolo relativo Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici.
Protocol
1. Ampio campo di vista di immagine pO2 in vascolarizzazione corticale di un topo
- Ratti (250 g -350 g) sono inizialmente anestetizzati con isoflurano, e l'arteria femorale e la vena sono cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per infusione endovenosa. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomia viene eseguita, ei ratti sono ventilati con una miscela di aria e ossigeno.
- I campioni di sangue per la misurazione del gas del sangue vengono effettuate ogni 30-45 min e la ventilazione e l'anestesia sono adeguati per mantenere il gas del sangue all'interno normale range fisiologico.
- Una finestra chiusa del cranio sul osso parietale 4 mm x 4 mm dimensioni è preparato per l'imaging. L'osso e la durata vengono rimossi e la finestra del cranio è riempita con 1,5% di agarosio e sigillato con un coprioggetto microscopio. Un ulteriore 1 mm 2 fori bava con l'osso frontale è usato per indurre CSD da microiniezione intracorticale di KCl (~ 10 microlitri, 1 M). Estrema cura deve essere presa per evitare ogni danno della vascolarizzazione corticale. Eccesso di calore, pressione meccanica, o breve periodo di ipossia può compromettere barriera sanguigna e causare perdite del colorante dal sistema vascolare nello spazio interstiziale.
- Una maschera da materiale otticamente opaco è collocato intorno finestra cranica. Lo scopo della maschera è quello di assorbire fosforescenza segnale che viene dal colorante che si sono riversate in tessuto dai bordi della materia dura. Il colorante nello spazio interstiziale è la fonte della fosforescenza molto luminoso che può rovinare la misura. La luminosità aumentata del colorante nello spazio interstiziale è risultato di accumulo del colorante in ambiente con bassa pressione di ossigeno e la frequenza tempra basso. Il danno del sistema vascolare in esperimento è quindi facilmente riconoscibile dalla comparsa di macchie luminose fosforescenza, nel qual caso viene respinto i dati sperimentali.
- Dopo il completamento della chirurgia, isoflurano è interrotto e l'anestesia è passati a alfa-cloraloso (50 mg / kg in bolo per via endovenosa seguiti da 40 mg / (kg h) infusione).
- Animale è trasferito su un carrello con pressione ventilatore, e monitorare la temperatura. Respirando l'aria della stanza, l'animale è rapidamente spostato al setup di imaging e riattaccato per il misuratore di portata con miscela appropriata di aria e ossigeno.
- Il telaio stereotassico che detiene l'animale è posto sotto l'obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell'obiettivo e posizionato parallelamente al piano focale.
- Il laser pulsato è acceso e impostato su impulso di energia minima. Il fascio ottico è diretto verso contatore di energia impulso ed energia impulso consegnato al campione viene regolato per essere non più di 10 mJ / cm 2. L'ISS raggio centrata sulla finestra del cranio con angolo di incidenza obliquo di circa 60 gradi e laser iss spento.
- Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell'animale erano all'interno normale range fisiologico.
- Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di R3 fosforescenza Oxyphor sonda è sciolto in 1 ml di soluzione fisiologica per ottenere 4 x 10 -5 M concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso la vena femorale.
- Una soluzione 1 M di cloruro di potassio è preparato e ~ 1 ul viene iniettata con la siringa attraverso il foro bava sull'osso frontale per indurre CSD.
- Il laser è acceso e l'imaging viene avviato subito dopo l'iniezione della soluzione di KCl. Imaging di fosforescenza viene eseguita durante ~ 10 min.
- Un'altra misura del gas nel sangue è eseguita a confermare che i parametri fisiologici degli animali sono ancora nel range di normalità.
- Vite fosforescenza si ottengono per tutti i pixel inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare quadrato con ponderazione statistica in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra).
2. Ad alta risoluzione a due fotoni pO2 imaging micro vascolarizzazione corticale del mouse
- I topi vengono anestetizzati con isofluorene arteria femorale ed è cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per la somministrazione del colorante. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C e gli animali sono in respiro spontaneo una miscela di aria e ossigeno.
- Una finestra del cranio è preparato secondo la tecnica originariamente sviluppata da David Kleinfeld e Winfried Denk. Una buona cura dovrebbe essere presa per evitare qualsiasi danno del sistema vascolare per evitare possibili perdite del colorante nello spazio interstiziale.
- Un paio di campioni di sangue per misurare i gas di sangue effettuato nel corso di una procedura di preparazione del tutto e la ventilazione e l'anestesia sono adeguati per tenere il gas nel sanguees nel normale range fisiologico.
- L'animale viene spostato al setup di imaging. Un telaio modificato stereotassica che detiene l'animale è posto sotto l'obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell'obiettivo Olympus 4X e posizionato parallelamente al piano focale.
- Un'immagine della finestra del cranio è presa con la fotocamera digitale attraverso gli oculari, e l'obiettivo 4X viene sostituito con l'obiettivo 20X Olympus (NA = 0,95).
- Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell'animale sono all'interno di un range di normalità fisiologico.
- Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di la fosforescenza sonda PtP-C343 è disciolto in 0,2 ml di soluzione fisiologica per ottenere ~ 15 mM concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso l'arteria femorale.
- Iniziare l'esperimento, impostando gli intervalli di tempo desiderato per l'eccitazione tintura e la raccolta di emissione per ogni pixel.
- Acquisire una scansione sondaggio che è un lento 2-dimensionale di scansione raster di degrado intensità fosforescenza che visualizza la struttura vascolare alla profondità attuale. L'obiettivo si sposta perpendicolarmente al finestrino del cranio (asse Z) e lenta scansione sondaggio 2D di intensità fosforescenza sono effettuate utilizzando la potenza minima laser a 840 nm per trovare la microvasi nel piano di imaging.
- Ad ogni profondità di imaging, basato sulla scansione sondaggio di fosforescenza a quella profondità, un insieme di punti all'interno del sistema vascolare sono selezionati, e la registrazione di decadimenti fosforescenza in ogni punto viene ripetuto per un numero predefinito di media.
- Impostare la quantità desiderata di media, intervallo di misura, e la durata sperimentare e avviare la misurazione. pO 2 misure vengono acquisite nelle posizioni selezionato con la frequenza di misura specificata per tutta la durata dell'esperimento.
- Durante le misurazioni, il software re-indirizza il laser di eccitazione alla località selezionate cambiando la posizione degli specchi scansione del galvanometro. Controllo degli scanner galvanometro, modulatore elettro ottico, e tutte le altre apparecchiature sono eseguite da software personalizzato realizzati in LabView.
- Vite fosforescenza sono ottenuti per tutti i punti selezionati inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare piazza in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra).
- Dopo aver raccolto i dati a profondità diverse corticale, iniettare destrano coniugato fluoresceina in vasi per l'imaging della struttura microcircolo.
- Ottenere una pila di immagini strutturali del sistema vascolare eseguendo i due fotoni di imaging di fluorescenza FITC utilizzando un canale verde nei quattro canali del rivelatore.
- Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Sottocommissione del Massachusetts General Hospital di ricerca sulla cura degli animali.
3. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Pannello (a) sul lato sinistro di questa figura mostra un ampio campo di vista dell'immagine della pressione di ossigeno prima dell'arrivo di un'onda CSD. Il grafico (b) sul lato destro mostra l'evoluzione temporale della pressione di ossigeno media durante la propagazione CSD all'interno della regione di interesse riportate sul grafico (a).
Figura 2 (avi film): Questo film mostra l'evoluzione temporale della pressione dell'ossigeno in tutta la finestra del cranio durante la propagazione dell'onda CSD. Barra di scala indica la pressione dell'ossigeno in millimetri di mercurio.
Figura 3. Proiezione 3D della pila vascolarizzazione immagine. Le tonalità di grigio rappresentano una maschera volumetrico nave, creato sulla base dell'immagine strutturale. PO 2 valori misurati sono colorati. Barra di scala è di 200 micrometri. Ristampato con il permesso di Nature Publishing Group 7.
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Discussion
Abbiamo dimostrato due applicazioni della misura pO2 nel microcircolo corticale sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Mentre il primo metodo basato sul CCD fornisce immagini a largo campo di vista di pO2 monitoraggio, misurazione della pressione parziale di ossigeno nel microcircolo corticale sulla base di 2-fotoni microscopia fornisce una risoluzione capillare e permette l'imaging in profondità. Entrambi i metodi forniscono ad alta velocità e alto rapporto segnale-rumore misurazioni. Inoltre, la misurazione vita fosforescenza di pO2 è in gran parte insensibile alle variazioni di parametri ottici del tessuto durante l'esperimento, che di solito è un problema per le altre tecniche di imaging ottico che hanno un meccanismo di contrasto sulla base di intensità. Strumenti presentati consentono l'analisi quantitativa della distribuzione dinamica di ossigeno e il metabolismo del tessuto cerebrale che porterà ad una migliore comprensione di accoppiamento neurovascolare nel cervello normale e malato
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il supporto da US National Institutes of concede Salute R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 e R01EB007279 e dell'American Heart Association concedere 0855772D.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
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