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Neuroscience

सेरेब्रल रक्त oxygenation phosphorescence के आक्सीजन पर निर्भर शमन के आधार पर मापन

doi: 10.3791/1694 Published: May 4, 2011

Summary

हम phosphorescence की ऑक्सीजन पर निर्भर शमन पर आधारित मस्तिष्क vasculature में ऑक्सीजन की आंशिक दबाव (pO2) को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया मौजूद है. पशु तैयारी और इमेजिंग प्रक्रियाओं दोनों चूहों में देखने सीसीडी आधारित pO2 की इमेजिंग के बड़े क्षेत्र और pO2 चूहों में उत्तेजना 2-photon आधारित इमेजिंग के लिए उल्लिखित थे.

Protocol

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1. एक चूहे के cortical vasculature में देखने इमेजिंग के pO2 के वाइड क्षेत्र

  1. चूहे (250 छ छ -350) isoflurane के साथ शुरू anesthetized हैं, और और्विक धमनी और शिरा के लिए दिल की दर, रक्तचाप और रक्त गैसों, अंतःशिरा निषेचन के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की निगरानी catheterized हैं. शरीर का तापमान 37 पर बनाए रखा है ± 0.1 ° सी. ट्रेकिआटमी प्रदर्शन किया है, और चूहों हवा और ऑक्सीजन का एक मिश्रण के साथ हवादार हैं.
  2. रक्त गैसों को मापने के लिए रक्त के नमूने ले रहे हैं हर 30-45 मिनट और वेंटिलेशन और संज्ञाहरण के सामान्य शारीरिक सीमा के भीतर रक्त गैसों रखने के लिए समायोजित कर रहे हैं.
  3. आकार में पार्श्विका हड्डी 4 मिमी x 4 मिमी पर एक बंद कपाल विंडो इमेजिंग के लिए तैयार है. हड्डी और dura हटा दिया है और कपाल विंडो 1.5% agarose के साथ भरा है और एक खुर्दबीन coverslip के साथ सील कर रहे हैं. एक अतिरिक्त 1 मिमी 2 ललाट की हड्डी पर गड़गड़ाहट छेद सीएसडी KCl (~ 10 μl, एम 1) के intracortical microinjection द्वारा प्रेरित किया है. चरम देखभाल के लिए cortical vasculature की किसी भी क्षति से बचने लिया जाना चाहिए. अत्यधिक गर्मी, यांत्रिक दबाव, या hypoxia का संक्षिप्त अवधि के vasculature से बीचवाला अंतरिक्ष में रक्त मस्तिष्क बाधा और डाई के कारण रिसाव समझौता हो सकता है.
  4. ऑप्टिकली अपारदर्शी सामग्री से एक मुखौटा कपाल खिड़की के आसपास रखा है. नकाब के उद्देश्य phosphorescence संकेत है कि डाई है कि dura बात के किनारों से ऊतक में लीक से आ रहा है अवशोषित है. बीचवाला अंतरिक्ष में डाई बहुत उज्ज्वल phosphorescence कि माप खराब कर सकते हैं का स्रोत है. बीचवाला अंतरिक्ष में डाई की वृद्धि हुई चमक डाई की कम ऑक्सीजन दबाव और कम शमन दर के साथ वातावरण में निर्माण का परिणाम है. प्रयोग में vasculature की क्षति इसलिए आसानी से उज्ज्वल phosphorescence स्पॉट है, जो मामले में प्रयोगात्मक डेटा को अस्वीकार कर दिया है की उपस्थिति के द्वारा मान्यता प्राप्त है.
  5. सर्जरी के पूरा होने के बाद, isoflurane बंद है और संज्ञाहरण alphachloralose (50 मिलीग्राम / किग्रा नसों सांस में 40 मिलीग्राम / (किलो ज) जलसेक द्वारा पीछा) के लिए बंद है.
  6. पशु वेंटीलेटर, ब्लड प्रेशर और तापमान की निगरानी के साथ एक गाड़ी पर स्थानांतरित किया है. जबकि कमरे में हवा में सांस लेने, जानवर जल्दी से इमेजिंग सेटअप करने के लिए ले जाया जाता है और हवा और ऑक्सीजन की उचित मिश्रण के साथ flowmeter reattached.
  7. stereotaxic फ्रेम है कि पशु धारण उद्देश्य के तहत रखा गया है. उद्देश्य के तहत कपाल खिड़की देखने के क्षेत्र में केंद्रित है और समानांतर फोकल हवाई जहाज़ के लिए तैनात है.
  8. स्पंदित लेजर चालू है और कम से कम पल्स ऊर्जा करने के लिए सेट. ऑप्टिकल बीम पल्स ऊर्जा मीटर और नाड़ी ऊर्जा नमूना वितरित की ओर निर्देशित है MJ / 2 सेमी 10 से अधिक नहीं हो समायोजित. किरण ~ 60 डिग्री और लेजर आईएसएस के परोक्ष घटना के कोण के साथ कपाल खिड़की पर केन्द्रित iss बंद कर दिया.
  9. रक्त गैस मापन और वेंटिलेशन और संज्ञाहरण के समायोजन प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक पशु के सभी शारीरिक मापदंड सामान्य शारीरिक सीमा के भीतर थे.
  10. मान लिया जाये कि रक्त की मात्रा शरीर के वजन के लगभग 7% है, phosphorescence जांच Oxyphor R3 का एक उचित मात्रा खारा के 1 एमएल 4 x 10 जांच के -5 एम खून एकाग्रता को प्राप्त करने में भंग कर रहा है. जांच समाधान ऊरु नस के माध्यम से इंजेक्शन है.
  11. पोटेशियम क्लोराइड के एक 1 एम समाधान तैयार है और ~ 1 उल सिरिंज के साथ ललाट की हड्डी पर गड़गड़ाहट छेद के माध्यम से इंजेक्शन है सीएसडी प्रेरित.
  12. लेजर चालू है और इमेजिंग KCl समाधान के इंजेक्शन के तुरंत बाद शुरू होता है. Phosphorescence की इमेजिंग ~ 10 मिनट के दौरान किया जाता है.
  13. एक और रक्त गैस माप पुष्टि करते हैं कि जानवर शारीरिक मापदंड सामान्य श्रेणी के भीतर अभी भी कर रहे हैं करने के लिए किया जाता है.
  14. Phosphorescence जन्मों सभी पिक्सल के लिए फिटिंग एकल घातीय क्षय Matlab में सांख्यिकीय भार के साथ nonlinear वर्ग फिटिंग का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. Phosphorescence जन्मों pO2 एक अनुभवजन्य Volmer तरह स्टर्न संबंध (बुनियादी ख़बरदार) का उपयोग करते हुए मानों को परिवर्तित कर रहे हैं.

2. उच्च संकल्प दो photon एक माउस के cortical सूक्ष्म vasculature में pO2 इमेजिंग

  1. चूहे anesthetized के साथ isofluorene और और्विक धमनी के लिए दिल की दर, रक्तचाप और रक्त गैसों, के रूप में अच्छी तरह से डाई के प्रशासन के लिए की निगरानी करने के लिए catheterized है. शरीर का तापमान 37 पर बनाए रखा ± 0.1 डिग्री सेल्सियस और पशुओं अनायास हवा और ऑक्सीजन का एक मिश्रण साँस ले रहे हैं.
  2. कपाल खिड़की के अनुसार मूल रूप से दाऊद Kleinfeld और Winfried Denk के द्वारा विकसित तकनीक के लिए तैयार है. एक अच्छी देखभाल करने के लिए vasculature की किसी भी क्षति से बचने के लिए बीचवाला अंतरिक्ष में डाई के संभव रिसाव को रोकने के लिया जाना चाहिए.
  3. एक पूरी तैयारी की प्रक्रिया के दौरान रक्त गैसों को मापने के लिए कुछ रक्त के नमूने ले रहे हैं और वेंटिलेशन और संज्ञाहरण रक्त गैस रखने के लिए समायोजित कर रहे हैंसामान्य शारीरिक सीमा के भीतर तों.
  4. पशु इमेजिंग सेटअप करने के लिए ले जाया गया है. एक संशोधित stereotaxic फ्रेम कि जानवर धारण उद्देश्य के तहत रखा गया है. कपाल खिड़की देखने के क्षेत्र में ओलिंप 4X उद्देश्य के तहत केंद्रित है और समानांतर फोकल हवाई जहाज़ के लिए तैनात है.
  5. कपाल विंडो के एक छवि eyepieces के माध्यम से डिजिटल कैमरा के साथ लिया जाता है, और 4X उद्देश्य ओलिंप 20X उद्देश्य (एनए = 0.95) के साथ प्रतिस्थापित किया गया है.
  6. रक्त गैस मापन और वेंटिलेशन और संज्ञाहरण के समायोजन जब तक पशु के सभी शारीरिक मापदंड एक सामान्य शारीरिक सीमा के भीतर कर रहे हैं प्रदर्शन कर रहे हैं.
  7. यह मानते हुए कि रक्त की मात्रा शरीर के वजन के लगभग 7%, phosphorescence जांच PTP-C343 के एक उचित मात्रा में है ~ जांच के 15 सुक्ष्ममापी रक्त एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए खारा 0.2 एमएल में भंग है. जांच समाधान और्विक धमनी के माध्यम से इंजेक्शन है.
  8. डाई और प्रत्येक पिक्सेल पर उत्सर्जन संग्रह उत्तेजना के लिए वांछित समय अंतराल की स्थापना के द्वारा प्रयोग शुरू करो.
  9. एक सर्वेक्षण स्कैन जो एक धीमी phosphorescence तीव्रता क्षय है कि वर्तमान गहराई में vasculature संरचना को प्रदर्शित करता है की 2 आयामी रेखापुंज स्कैन है मोल. उद्देश्य सीधा कपाल विंडो में ले जाया जाता है (z अक्ष) और 840 एनएम न्यूनतम लेसर शक्ति का उपयोग इमेजिंग विमान में microvessels खोजने के धीमी phosphorescence तीव्रता के 2D सर्वेक्षण स्कैन लिया जाता है.
  10. प्रत्येक इमेजिंग गहराई, कि गहराई में phosphorescence के सर्वेक्षण स्कैन पर आधारित vasculature के भीतर अंक का एक सेट का चयन किया है, और प्रत्येक बिंदु पर phosphorescence decays की रिकॉर्डिंग औसत के एक पूर्वनिर्धारित संख्या के लिए दोहराया है.
  11. औसत की वांछित राशि, माप अंतराल, और प्रयोग की अवधि सेट और माप शुरू. PO 2 माप निर्दिष्ट माप अंतराल पर चयनित स्थानों पर प्रयोग की अवधि के लिए अर्जित कर रहे हैं .
  12. माप के दौरान, सॉफ्टवेयर galvanometer स्कैनिंग दर्पण की स्थिति को बदलने के द्वारा चयनित स्थानों के लिए उत्तेजना लेजर पुनः निर्देशन. Galvanometer स्कैनर, इलेक्ट्रो ऑप्टिकल न्यूनाधिक, और अन्य सभी उपकरणों का नियंत्रण Labview में कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं.
  13. Phosphorescence जन्मों सभी चयनित अंक के लिए फिटिंग एकल घातीय क्षय Matlab में nonlinear वर्ग फिटिंग का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. Phosphorescence जन्मों pO2 एक अनुभवजन्य Volmer तरह स्टर्न संबंध (बुनियादी ख़बरदार) का उपयोग करते हुए मानों को परिवर्तित कर रहे हैं.
  14. विभिन्न cortical गहराई में डाटा एकत्रित करने के बाद, vasculature में microvasculature संरचना इमेजिंग के लिए dextran संयुग्मित fluorescein डाई इंजेक्षन.
  15. एक vasculature की छवियों संरचनात्मक का एक ढेर FITC प्रतिदीप्ति के दो photon इमेजिंग प्रदर्शन डिटेक्टर चार चैनल में एक हरे रंग चैनल का उपयोग करके प्राप्त करते हैं.
  16. जानवरों पर प्रयोग शोध जानवर की देखभाल पर मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल उपसमिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1. यह आंकड़ा के बाईं तरफ पैनल (एक) एक सीएसडी लहर के आने से पहले ऑक्सीजन दबाव के दृश्य छवि की एक विस्तृत क्षेत्र प्रदर्शित करता है. सही पक्ष पर पैनल (ख) के पैनल पर चिह्नित ब्याज के क्षेत्र के भीतर सीएसडी प्रचार के दौरान औसत ऑक्सीजन दबाव के अस्थायी विकास (क) से पता चलता है.

चित्रा 2 (AVI फिल्म): यह फिल्म सीएसडी लहर के प्रचार के दौरान पूरे कपाल विंडो में ऑक्सीजन दबाव के अस्थायी विकास से पता चलता है. स्केल बार पारा के मिलीमीटर में ऑक्सीजन के दबाव इंगित करता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 imaged vasculature के ढेर के 3D प्रक्षेपण. भूरे रंग के एक बड़ा पोत मुखौटा का प्रतिनिधित्व करते हैं, संरचनात्मक छवि पर आधारित बनाया. मापाकरे PO 2 मूल्यों रंग - कोडित रहे हैं. स्केल बार 200 micrometers है. प्रकृति प्रकाशन समूह से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित 7.

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Discussion

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हम pO2 cortical microvasculature में माप phosphorescence की ऑक्सीजन पर निर्भर शमन पर आधारित दो अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया. जबकि पहले सीसीडी इमेजिंग के आधार पर विधि pO2 के दृश्य निगरानी की व्यापक क्षेत्र प्रदान करता है, cortical microvasculature में ऑक्सीजन की आंशिक दबाव 2-photon माइक्रोस्कोपी पर आधारित मापने केशिका संकल्प प्रदान करता है और गहराई में इमेजिंग की अनुमति देता है है. दोनों तरीकों उच्च गति और उच्च संकेत करने वाली शोर माप उपलब्ध कराते हैं. इसके अलावा, pO2 phosphorescence जीवनकाल माप बड़े पैमाने पर प्रयोग है, जो आमतौर पर अन्य ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक है कि एक विपरीत तीव्रता पर आधारित तंत्र के लिए एक चिंता का विषय है के दौरान ऊतक के ऑप्टिकल मापदंडों में परिवर्तन के लिए असंवेदनशील है. प्रस्तुत उपकरणों ऑक्सीजन की गतिशील वितरण और मस्तिष्क के ऊतकों चयापचय है कि सामान्य और रोगग्रस्त दिमाग में neurovascular युग्मन के एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति

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Acknowledgments

हम स्वास्थ्य R01NS057476 अनुदान, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 और R01EB007279 और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 0855772D के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Glycopyrrolate Reagent American Regent Inc. NDC 0517-4605-25 Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.
Lidocaine HCL Reagent Hospira Inc. NDC 0409-4277-01 Used as the local anesthesia during surgeries.
Isoflurane Reagent Baxter Internationl Inc. NDC 10019-360-40 Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.
Alpha Chloralose Reagent Sigma-Aldrich C0128 Used as a general anesthesia during experiments with rats.
Fluorescein isothio-cyanate–dextran Reagent Sigma-Aldrich FD2000S Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.

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References

  1. Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. Humana Press Inc. (2007).
  2. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. (2008).
  3. Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. (2009).
  4. Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
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  6. Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
  7. Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
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Sakadžić, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Wu, W., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence. J. Vis. Exp. (51), e1694, doi:10.3791/1694 (2011).More

Sakadžić, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Wu, W., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence. J. Vis. Exp. (51), e1694, doi:10.3791/1694 (2011).

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