可视化的RNA中的本地化爪蟾卵母细胞

Summary

可视化

Abstract

RNA本地化是一个保守的机制，建立细胞极性。 VG1基因定位于非洲爪蟾卵母细胞和行为空间限制VG1蛋白基因表达的植物极。 VG1分布严格控制，这种方式是需要适当的生殖发育中的胚胎层规范。 RNA序列的mRNA的3'UTR区的元素，VG1本地化元素（VLE）是必要的和足够的直接运输。要研究的认可和VG1基因在体内的运输，我们已开发出一种成像技术，可以通过一个简单的视觉读数跨因素的传输机制进行了广泛分析。

为了形象化RNA的本地化，我们合成荧光标记的VLE的RNA和microinject到个人的卵母细胞成绩单。后卵母细胞培养，让注入的RNA运输，卵母细胞共聚焦显微镜成像前固定和脱水。 mRNA的本土化模式的可视化提供了一个监测完整的RNA运输途径，并确定独联体范围内行事的成绩单和反式作用因子结合VLE（刘易斯等人，2008年的元素，在指导RNA的运输角色的读数Messitt等，2008）。我们已经扩展这种技术通过共同本地化与其他RNA和蛋白质（加尼翁和Mowry，2009年，Messitt等，2008），并结合马达蛋白和细胞骨架的破坏等，2008）（Messitt探测mRNA的本地化的内在机制，。

Protocol

第1部分：荧光标记基因的转录。

1. 含有RNA的本地化元素或其他相关序列的质粒DNA线性化和重悬在1μg/μL的DEPC处理_过的H 2 O DNA模板必须有T7，SP6，T3 RNA聚合酶转录上游启动网站。
2. 无菌1.5ml离心管加入下列试剂：

   A. 10X Tx缓冲区（见M＆M的）	2μL
   B. 20X帽/ NTP的组合（见M＆M的）	1μL
   C. 1毫米的Alexa Fluor 546 - 14 - UTP（Invitrogen公司）	1μL
   D.双绞线，[α- 32 P]（1μCi/μL）（Perkin Elmer公司）	1μL
   E. DEPC - H 2 O	11μL
   F. 0.2中号数码地面电视	1μL
   G. RNasin（Promega公司）	1μL
   H.线性DNA模板	1μL
   一RNA聚合酶（Promega公司）	1μL

3. 轻轻混合试剂，并短暂离心​​（10秒。微量）。
4. 在37 ° C孵育2-4小时，覆盖铝箔，以防止荧光团的漂白管。
5. 添加1μL1 mg / ml的无RNase的DNA酶（Promega公司），以降低模板DNA。
6. 孵育15分钟，在37 ° C。
7. 加入79μL20 mM的EDTA（pH 8.0）中终止反应。
8. 标示为“输入”并保存到一个单独的管，取出1μL。
9. 自旋通过1毫升G50列的反应（见材料与方法），其中将包括非法人核苷酸，而不含全长基因。
10. 集中乙醇沉淀的RNA：
    1. 加入250μL100％的乙醇，10μL7M CH ₃ COONH _4，1μL载体RNA（酵母tRNA，10μg/μL的）1μL糖原（20毫克/毫升）。
    2. 拌匀，和冻结，直到固体在-80 ° C下30分钟或15分钟干冰。
    3. 以最大速度离心15分钟，倒出上清液旋转。
    4. 洗干净的75％乙醇150μL。
    5. 3分钟以最大的速度旋转的离心，倒出上清液。
    6. 沉淀在37 ° C干燥3分钟，确保所有的乙醇蒸发。
11. 重悬在11μLDEPC - H _{2 O，}并取出1μL到一个单独的管，标示为“收编” 。
12. 确定％掺入稀释到50纳米的RNA（见材料及计算方法）。
13. 应冻结在5μL等份的RNA，为一次性使用，避免冻结/解冻周期，几个星期可以储存在-80 ° C

第2部分：显微注射准备。

1. RNA制备：
   解冻RNA（50海里）的分装，变性的RNA在70 ° 3-5分钟彗星。在房间温度最高速度离心旋转，以消除任何微粒，并保持在冰上10分钟。
2. 卵母细胞的制备：
   1. 手术去除卵巢爪蟾女性（NASCO）。
   2. 修剪成50毫升含有胶原酶溶液25毫升的锥形管件（见材料与方法） 的爪蟾卵巢。
   3. 在18 ° C，15分钟后，轻轻摇动或直到明显从卵巢中分离的卵母细胞。由于一批一批变异，胶原酶治疗时间可能会有所不同，应仔细监测通过目视检查确保defoliculation。
   4. 允许卵母细胞在管解决，消除解决方案，并用MBSH缓冲区的卵母细胞（见材料与方法）。
   5. 共有3个洗，重复洗两倍以上。这种卵母细胞隔离协议，是相似的，在科恩等人，2009年的详细。
   6. 手动排序阶段III / IV期的卵母细胞在MBSH缓冲区（杜蒙，1972年），一个标准的解剖显微镜下。第三阶段卵母细胞是完全不透明的，但白色的，而Ⅳ期的卵母细胞稍大，色素斑点。略带透明的卵母细胞，都太年轻，卵母细胞，充分色素或展示极化色素分布过​​于陈旧。
3. 针的制备：
   拉和斜面针〜0.05毫米外径。 （我们使用3.5英寸的毛细血管德拉蒙德科学（订单＃3 - 000 - 203 - G / X），一个苏特仪器有限公司微量车夫和一个WPI公司beveller。）

第3部分：显微注射

1. 校准用DEPC - H _{2 O}针，每次注射2 NL提供。我们前面加载我们的针使用天然气驱动的微量（见材料与方法），并使用千分尺校准墨滴大小。
2. 装入针的RNA。
3. 将整理成卵母细胞注射含有MBSH缓冲盘。我们microinject碟子上了一层黑色泡沫橡胶。苍白的卵母细胞的立场以及在一个白色backgrouND。
4. 小心2 NL的RNA注入每个卵母细胞，在50纳米。
5. 驱逐的RNA，用DEPC - H _{2 O}冲洗针，并加载注射下一RNA。

第4部分：卵母细胞培养

1. 在一个无菌24孔板（西格玛爱秩序）以及卵母细胞。我们文化的每口井千卵母细胞。
2. 删除的缓冲区，并更换与400μLØ ocyte彗星ulture中号edium器（OCM，材料与方法）每口井。培养板内放置一个不透气的塑料容器用湿纸巾保持在潮湿的环境文化。
3. 在18 ° C为8和48小时不等的时间点培养的卵母细胞。

第5部分：固定，脱水和存储的卵母细胞

1. 理清任何死卵母细胞，并将其放置在玻璃小瓶中幸存的卵母细胞。我们经常观察> 90％的生存。
2. MEMFA固定液（见材料与方法）和20分钟的岩石卵母细胞。用铝箔纸覆盖，防止光线照射的卵母细胞。
3. 洗卵母细胞，通过去除固定液和更换同等体积MBSH缓冲区。再次重复此一共有两个洗的洗。
4. 洗净放入无水甲醇卵母细胞：
   1. 取出量的一半，用甲醇代替。
   2. 重复的步骤“的”两次。
   3. 删除所有的解决方案，用甲醇代替。
   4. 重复甲醇洗。
5. 卵母细胞可以储存在-20 ° C，直到准备好形象。

第6部分：共聚焦显微镜成像RNA的本地化

1. 在成像之前，加美利小号结算中（2:1苯甲酸苄酯苄醇）玻璃底部FluoroDish（WPI的公司），覆盖成像表面。
2. 仔细的卵母细胞转移甲醇FluoroDish，减少体积的甲醇转移。
3. 一个倒置的共聚焦显微镜图像（我们已经成功地使用了蔡司LSM510的Leica TCS SP2）。

图1：最初是可视化的亚细胞RNA的本地化注射荧光标记的成绩单A.经过显微注射，RNA的Alexa Fluor 546标记的限制，以细胞核 B.经过8小时的文化，一个荧光标记的对照RNA可以看到均匀分布在卵母细胞的细胞质中。然而，荧光标记的RNA序列招聘运输机械，可以在亚细胞定位的卵母细胞（向底部）的植物极的过程中看到。比例尺= 50微米。

Discussion

在这里，我们提出了一个可视化mRNA 的爪蟾卵母细胞的本地化的协议。这种方法，使用荧光标记的RNA转录，具有较高的信噪比比以前取得与地高辛标记的成绩单和比在原位（Mowry和麦尔登，1992年，Gautreau等，1997）为基础的方法更简单，速度更快。使用这种方法，我们可以设计RNA序列突变，并迅速在体内的功能测试。此外，通过使用额外的Alexa的双绞线荧光团，多个RNA的物种可以被可视化在同卵母细胞。我们发现，在爪蟾卵母细胞的Alexa Fluor 546 - 14 -双绞线提供了优异的业绩的Alexa Fluor 488 - 5 - UTP，因为在488 nm波长范围内的自体荧光相比，然而，两个RNA分子的双成像，但有可能（加尼翁和Mowry，2009年）。此外，这种技术结合免疫协议来检测蛋白的共定位效果很好，可作为多种兼容的荧光抗体（Yoon和Mowry，2006年，Messitt等，2008）。最后，通过过度表达占主导地位的不利因素或小分子干扰RNA的本地化进程的中断，可以结合这个实验中，可视化的mRNA本地化途径的细微的缺陷（Messitt等，2008）。这项技术已被证明是一个相对简单和可靠的检测，检测基因在体内的分布和，可以轻松地集成到现有的生化，分子和细胞生物技术用于探测mRNA的运输机制。

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.