Visualisation de localisation de l'ARN Xenopus Les ovocytes

Summary

Visualisation des

Abstract

La localisation d'ARN est un mécanisme conservé d'établir la polarité cellulaire. Vg1 ARNm se localise dans le pôle végétal des ovocytes de Xenopus laevis et agit pour restreindre l'espace d'expression génique des protéines Vg1. Un contrôle strict de la distribution Vg1 de cette manière est requise pour la spécification de la couche germe de bon dans l'embryon en développement. Des éléments de séquence d'ARN en 3 'UTR de l'ARNm, l'élément Vg1 localisation (VLE) sont nécessaires et suffisantes pour le transport direct. Pour étudier la reconnaissance et de transport de Vg1 ARNm in vivo, nous avons développé une technique d'imagerie qui permet une analyse approfondie des facteurs de trans-mécanismes de transport dirigé via une lecture visuelle simple.

Pour visualiser la localisation d'ARN, nous synthétisons marqué par fluorescence ARN VLE et microinject cette transcription dans des ovocytes individuels. Après la culture des ovocytes pour permettre le transport de l'ARN injecté, les ovocytes sont fixes et déshydratés avant d'imagerie par microscopie confocale. Visualisation des schémas de localisation d'ARNm fournit une lecture de surveillance de la voie complète de l'ARN de transport et d'identification des rôles dans la direction de l'ARN de transport pour les éléments agissant en cis au sein de la transcription et facteurs agissant en trans qui se lient à l'VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nous avons étendu cette technique à travers la co-localisation avec des ARN et des protéines supplémentaires (Gagnon et Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), et en combinaison avec perturbation des protéines motrices et le cytosquelette (Messitt et al., 2008) à la sonde mécanismes sous-jacents de localisation d'ARNm.

Protocol

Partie 1: La transcription de l'ARNm marqué par fluorescence.

1. Linéariser l'ADN plasmidique contenant l'élément de localisation ou d'autres séquences d'ARN pertinentes et remettre à 1 ug / ul avec DEPC traitées H ₂ O. La matrice d'ADN doit avoir des sites promoteur en amont de la transcription par T7, SP6 ou T3 ARN polymérase.
2. Ajouter les réactifs suivants dans un tube stérile de 1,5 ml:

   a. Tx 10X tampon (voir M & M)	2 pl
   b. 20X CAP / NTP mélanger (voir M & M)	1 pl
   C. 1 mM Alexa Fluor 546 au 14-UTP (Invitrogen)	1 pl
   d. UTP, [α-32 P] (1 pCi / pl) (Perkin Elmer)	1 pl
   e. DEPC-H 2 O	11 ul
   f. 0,2 M de DTT	1 pl
   g. RNasine (Promega)	1 pl
   h. ADN matrice linéaire	1 pl
   i. ARN polymérase (Promega)	1 pl

3. Mélanger délicatement les réactifs et centrifuger brièvement (10 sec. Dans une microcentrifugeuse).
4. Incuber pendant 2-4 heures à 37 ° C, couvrant le tube avec du papier aluminium pour éviter photoblanchiment des fluorophores.
5. Ajouter 1 pl 1 mg / ml sans RNase DNase (Promega) pour dégrader l'ADN matrice.
6. Incuber 15 minutes à 37 ° C.
7. Ajouter 79 ul EDTA 20 mM (pH 8,0) pour arrêter la réaction.
8. Retirer 1 ul d'un tube séparé, étiqueté comme "entrée" et sauvegarder.
9. De réaction à travers un Spin 1 ml G50 colonne (voir Matériaux & Procédés), qui comprendra les nucléotides non constituée en société, tout en excluant l'ARNm de pleine longueur.
10. Concentrer l'ARN par précipitation à l'éthanol:
    1. Ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, 10 pl 7M CH ₃ COONH _4, 1 porte-ul d'ARN (ARNt de levure, 10 pg / pl) ou 1 ul glycogène (20 mg / ml).
    2. Mélangez bien et congeler jusqu'à solide à -80 ° C pour> 30 minutes ou sur la glace sèche pendant 15 minutes.
    3. Centrifuger à vitesse maximale dans microcentrifugeuse pendant 15 minutes, le surnageant décanter.
    4. Laver avec 150 ul d'éthanol à 75%.
    5. Spin 3 minutes à vitesse maximale dans microcentrifugeuse, surnageant décanter.
    6. Sécher les granulés à 37 ° C pendant 3 minutes, en s'assurant que tout l'éthanol s'est évaporée.
11. Remettre en suspension dans 11 ul DEPC-H ₂ O et de supprimer 1 pl d'un tube séparé, étiqueté comme «constituée».
12. Déterminer l'incorporation pour cent et de diluer l'ARN à 50 nm (voir Matériaux & Méthodes de calcul).
13. Les ARN doivent être congelés en 5 aliquotes, à usage unique pour éviter les cycles gel / dégel et peuvent être stockées pendant plusieurs semaines à -80 ° C.

Partie 2: Préparation à la microinjection.

1. Préparation d'ARN:
   Dégeler une aliquote de l'ARN (50 nM), et de dénaturer l'ARN à 70 ° C pendant 3-5 minutes. Spin pendant 10 minutes dans microcentrifugeuse température ambiante à la vitesse maximale pour enlever toutes les particules, et de garder sur la glace.
2. Préparation des ovocytes:
   1. Enlever chirurgicalement des ovaires de Xenopus laevis femelles (NASCO).
   2. Pièces de garniture de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de solution de collagénase (voir Matériaux & Procédés).
   3. Agiter doucement à 18 ° C pendant 15 minutes, ou jusqu'à ce que les ovocytes sont visiblement séparées de l'ovaire. En raison de la variation lot à lot, temps de traitement de la collagénase peut varier et doit être surveillée attentivement par l'inspection visuelle pour s'assurer defoliculation.
   4. Autoriser ovocytes à s'installer dans le tube, enlever la solution et laver les ovocytes avec le tampon MBSH (voir Matériaux & Procédés).
   5. Répétez laver deux fois plus pour un total de trois lavages. Ce protocole d'isolement d'ovocytes est similaire à celui détaillé dans Cohen et al., 2009.
   6. Trier manuellement stade III / IV ovocytes (Dumont, 1972) dans un tampon de MBSH sous un microscope standard à dissection. Etape III ovocytes sont complètement opaques, mais blanc, alors que le stade IV ovocytes sont légèrement plus grandes et tacheté avec des pigments. Ovocytes qui sont légèrement transparents sont trop jeunes et que les ovocytes totalement pigmentées ou la distribution de pigments présentent polarisés sont trop vieux.
3. Préparation d'aiguille:
   Tirez et biseau des aiguilles d'un diamètre extérieur de ~ 0,05 mm. (Nous utilisons Drummond Scientific 3,5 pouces capillaires (ordre n ° 3-000-203-G / X), une Sutter Instrument Co. micropipette extracteur et un WPI Inc angleur.)

Partie 3: microinjection

1. Calibrer aiguille avec DEPC-H ₂ O 2 pour livrer nl par injection. Nous en charge avant notre aiguille en utilisant un gaz microinjecteur moteur (voir Matériels & Méthodes), et de calibrer la taille de goutte à l'aide d'un micromètre.
2. Charge d'ARN dans l'aiguille.
3. Placez triés ovocytes dans un plat contenant un tampon d'injection MBSH. Nous microinject sur un plat avec une couche de mousse de caoutchouc noir. Les ovocytes pâles ressortent bien sur un backgrou blanchend.
4. Soigneusement injecter chaque ovocyte avec 2 nl d'ARN à 50 nM.
5. Expulsez l'ARN, rincer l'aiguille avec DEPC-H ₂ O, et de la charge d'ARN suivante pour l'injection.

Partie 4: Culture ovocytes

1. Ovocytes Placer dans un puits d'une plaque de stériles 24 puits (Sigma Aldrich). Nous culture jusqu'à un millier d'ovocytes par puits.
2. Retirer tampon et le remplacer par 400 pl O C ulture ocyte M oyen (OCM, voir Matériaux & Procédés) par puits. Plaque de culture Placer dans un récipient hermétique en plastique avec une serviette en papier humide pour maintenir l'environnement humide pendant la culture.
3. Incuber ovocytes à 18 ° C pour les points de temps compris entre 8 et 48 heures.

Partie 5: fixation, déshydratation et stockage des ovocytes

1. Trier les ovocytes morts et le lieu ovocytes survivre dans des flacons en verre. Nous observons régulièrement de survie> 90%.
2. Placer dans des ovocytes MEMFA de fixation (voir Matériaux & Procédés) et du rock pendant 20 minutes. Protéger les ovocytes de la lumière en couvrant avec du papier aluminium.
3. Lavez ovocytes en supprimant fixateur et le remplacer par un volume égal de tampon MBSH. Répéter ce lavage une fois de plus pour un total de deux lavages.
4. Lavez ovocytes en méthanol anhydre:
   1. Retirer la moitié du volume, le remplacer par du méthanol.
   2. Répétez l'étape "a" deux fois.
   3. Enlevez toute la solution, le remplacer par du méthanol.
   4. Répétez lavage au methanol.
5. Les ovocytes peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'au moment de l'image.

Partie 6: Imagerie ARN localisation par microscopie confocale

1. Avant d'imagerie, ajoutez moyen Murray s Clearing (02h01-benzoate de benzyle alcool benzylique) à un fond de verre FluoroDish (WPI Inc) pour couvrir la surface d'imagerie.
2. Soigneusement transférer les ovocytes à partir de méthanol à FluoroDish, en minimisant le volume de méthanol transférés.
3. Image sur un microscope inversé confocal (Nous avons utilisé avec succès un LSM510 Zeiss et Leica TCS SP2).

Figure 1:.. Visualisation de l'ARN localisation subcellulaire par microinjection d'Transcriptions par fluorescence Labelled A. Après microinjection, ARN marqués avec Alexa Fluor 546 est initialement limité au noyau B. Après huit heures de culture, un ARN marqué par fluorescence de contrôle peut être vu de manière uniforme distribués dans le cytoplasme de l'ovocyte. C. Cependant, l'ARN marqué par fluorescence contenant des séquences qui recrutent des engins de transport peut être vu dans le processus de localisation subcellulaire du pôle végétal de l'ovocyte (vers le bas). Barre d'échelle = 50 microns.

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole pour la visualisation de la localisation d'ARNm dans les ovocytes de Xénope. Cette méthode, en utilisant des ARN transcrits marqués par fluorescence a plus de signal sur bruit que précédemment obtenus avec marquées à la digoxigénine transcriptions et est plus simple et plus rapide que in situ des approches fondées (Mowry et Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). En utilisant cette méthode, nous pouvons concevoir l'ARN mutations séquence et tester rapidement des fonction in vivo. De plus, en utilisant d'autres Alexa-UTP fluorophores, plusieurs espèces d'ARN peuvent être visualisées dans l'ovocyte même. Nous avons constaté que dans Alexa Fluor ovocytes de Xenopus 546-14-UTP donne des résultats supérieurs par rapport à Alexa Fluor 488-5-UTP cause de l'autofluorescence dans la gamme 488 nm de longueur d'onde, mais l'imagerie double de deux ARN est néanmoins possible (Gagnon et Mowry, 2009). En outre, cette technique fonctionne bien en conjonction avec les protocoles de détection immunologique colocalisation des protéines, comme une grande variété d'anticorps secondaires fluorescents compatibles sont disponibles (Yoon et Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Enfin, la perturbation du processus de localisation d'ARN grâce à la surexpression de dominants négatifs ou facteurs d'interférence de petites molécules peuvent être combinées avec ce dosage de visualiser des défauts subtils dans la voie de la localisation d'ARNm (Messitt et al., 2008). Cette technique s'est avérée être un test relativement simple et robuste pour la détection de l'ARNm de distribution in vivo et peuvent être intégrés facilement dans existantes biochimiques, moléculaires et cellulaires des techniques biologiques pour sonder les mécanismes de transport d'ARNm.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.