Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Summary

Visualisierung von

Abstract

RNA-Lokalisierung ist eine konservierte Mechanismus der Gründung Zellpolarität. Vg1 mRNA lokalisiert den vegetativen Pol des Xenopus laevis Oozyten und wirkt räumlich beschränken Genexpression Vg1 Protein. Eine strenge Kontrolle der Vg1 Verteilung auf diese Weise ist für die ordnungsgemäße Keim-Layer-Spezifikation in den sich entwickelnden Embryo erforderlich. RNA-Sequenz-Elemente in der 3 'UTR der mRNA, die Vg1 Lokalisierungselement (VLE) erforderlich und ausreichend, um auf direktem Wege. Zur Untersuchung der Anerkennung und der Transport von Vg1 mRNA in vivo, haben wir ein bildgebendes Verfahren, die umfassende Analyse der trans-Faktor gerichteten Transport-Mechanismen ermöglicht über eine einfache visuelle Ablesung entwickelt.

Zur Visualisierung RNA-Lokalisierung, synthetisieren wir fluoreszenzmarkierten VLE RNA und microinject dieses Transkript in einzelne Eizellen. Nach Eizelle Kultur, um den Transport der injizierten RNA zu ermöglichen, sind Eizellen fixiert und dehydriert vor Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Visualisierung der mRNA-Lokalisierung Muster bietet eine Anzeige für die Überwachung der kompletten Pfad der RNA-Transport und für die Ermittlung Rollen in Regie RNA-Transport für cis-wirkende Elemente innerhalb der Transkript-und trans-wirkende Faktoren, die zur VLE (Lewis et al., 2008 zu binden, Messitt et al., 2008). Wir haben diese Technik durch Co-Lokalisation erweitert mit zusätzlichen RNAs und Proteinen (Gagnon und Mowry 2009, Messitt et al., 2008) und in Kombination mit Störungen der motorischen und des Zytoskeletts (Messitt et al., 2008) zur Sonde Mechanismen, die mRNA-Lokalisierung.

Protocol

Teil 1: Transkription von fluoreszenzmarkierten mRNA.

1. Linearisieren Plasmid-DNA mit dem RNA-Lokalisierung Element oder anderen relevanten Sequenz-und resuspendieren bei 1 ug / ul mit DEPC-behandeltem H ₂ O. Die DNA-Vorlage muss stromaufwärts liegende Promotor Standorte für die Transkription durch T7, SP6 oder T3-RNA-Polymerase.
2. Fügen Sie die folgenden Reagenzien in ein steriles 1,5 ml Tube:

   a. 10X Tx-Puffer (siehe M & M)	2 ul
   b. 20X Kappe / NTP-Mix (siehe M & M)	1 ul
   c. 1 mM Alexa Fluor 546 bis 14-UTP (Invitrogen)	1 ul
   d. UTP, [α-32 P] (1 Ci / ul) (Perkin Elmer)	1 ul
   e. DEPC-H 2 O	11 ul
   f. 0,2 M DTT	1 ul
   g. RNasin (Promega)	1 ul
   h. lineare Template-DNA	1 ul
   i. RNA Polymerase (Promega)	1 ul

3. Mix Reagenzien sanft und kurz zentrifugieren (10 sec. In einer Mikrozentrifuge).
4. Inkubieren für 2-4 Stunden bei 37 ° C, für das Rohr mit Alu-Folie zu verhindern Ausbleichen des Fluorophors.
5. Fügen Sie 1 ul 1 mg / ml RNase-freie DNase (Promega) zur Template-DNA abzubauen.
6. Inkubieren 15 Minuten bei 37 ° C.
7. Add 79 ul 20 mM EDTA (pH 8,0), um die Reaktion zu stoppen.
8. Nehmen Sie 1 ul in ein separates Röhrchen, als "Input" und speichern Sie beschriftet.
9. Spin Reaktion durch ein 1 ml G50-Säule (siehe Material und Methoden), die ohne eigene Rechtspersönlichkeit, Nukleotide umfassen wird unter Ausschluss voller Länge mRNA.
10. Konzentrieren Sie sich die RNA durch Ethanolfällung:
    1. Add 250 ul 100% Ethanol, 10 ul 7M CH ₃ COONH _4, 1 ul Träger-RNA (tRNA Hefe, 10 ug / ul) oder 1 ul Glykogen (20 mg / ml).
    2. Gut mischen und einfrieren, bis Feststoff bei -80 ° C für> 30 Minuten oder auf Trockeneis für 15 Minuten.
    3. Spin bei maximaler Geschwindigkeit in Mikrozentrifuge für 15 Minuten, dekantieren.
    4. Waschen mit 150 ul 75% Ethanol.
    5. Spin 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in Mikrozentrifuge, dekantieren.
    6. Dry das Pellet bei 37 ° C für 3 Minuten, sicherzustellen, dass alle Ethanol verdampft ist.
11. Resuspendieren in 11 ul DEPC-H ₂ O und entfernen 1 ul in ein separates Röhrchen, als "integriert" bezeichnet.
12. Bestimmen Sie die prozentuale Aufnahme und verdünnt das RNA zu 50 nM (siehe Materialien und Methoden für die Berechnung).
13. Die RNA sollte in 5 ul Aliquots eingefroren werden, für den einmaligen Gebrauch, um Frost / Tau-Zyklen zu vermeiden und kann mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden

Teil 2: Vorbereitungen für die Mikroinjektion.

1. RNA Zubereitung:
   Tauwetter ein Aliquot von RNA (50 nM) und Denaturierung der RNA bei 70 ° C für 3-5 Minuten. Spin für 10 Minuten bei Raumtemperatur Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zu jedem Teilchen zu entfernen, und halten Sie auf dem Eis.
2. Oocyte Zubereitung:
   1. Chirurgisch entfernen Eierstock aus Xenopus laevis Weibchen (Nasco).
   2. Trim Stücke von Xenopus laevis Ovarien in einen 50 ml konische Röhrchen mit 25 ml Collagenase-Lösung (siehe Materialien und Methoden).
   3. Vorsichtig schütteln bei 18 ° C für 15 Minuten, oder bis Eizellen sind sichtbar von Eierstock getrennt. Aufgrund Chargenstreuung kann Kollagenasebehandlung Zeit variieren und müssen sorgfältig durch Sichtprüfung überwacht werden, um defoliculation zu gewährleisten.
   4. Lassen Eizellen in Rohr zu regeln, zu entfernen Lösung und Waschen der Eizellen mit MBSH Puffer (siehe Material und Methoden).
   5. Wiederholen Sie waschen zweimal für insgesamt drei Wäschen. Diese Eizelle Isolation Protokoll ist ähnlich dem detaillierten in Cohen et al., 2009.
   6. Manuell sortieren im Stadium III / IV Oozyten (Dumont, 1972) in MBSH Puffer unter einem Standard-Binokular. Stadium III Oozyten sind völlig undurchsichtig, aber weiß, während im Stadium IV Oozyten etwas größer und gesprenkelt mit Pigment. Eizellen, die leicht transparent sind zu jung und Eizellen, die vollständig pigmentiert oder weisen polarisierte Verteilung der Pigmente zu alt sind.
3. Needle Zubereitung:
   Pull-und Kegel-Nadeln mit einem äußeren Durchmesser von ~ 0,05 mm. (Wir verwenden Drummond Scientific 3,5-Zoll-Kapillaren (Bestellung Nr. 3-000-203-G / X), eine Sutter Instrument Co. Mikropipette Abzieher und ein WPI Inc. Schweißkantenformer.)

Teil 3: Mikroinjektion

1. Kalibrieren Nadel mit DEPC-H ₂ O zu 2 nl pro Injektion zu liefern. Wir Frontlader unsere Nadel mit einem gasbetriebenen Mikroinjektor (siehe Materialien und Methoden), und kalibrieren Tropfengröße mit einem Mikrometer.
2. Laden RNA in Nadel.
3. Ort sortiert Eizellen in ein Spritzgießwerkzeug Schale mit MBSH Puffer. Wir konzentrieren uns auf einen Teller microinject mit einer Schicht aus schwarzem Moosgummi. Der blasse Eizellen zeichnen sich auch auf einem weißen backgrouND.
4. Sorgfältig spritzen jede Eizelle mit 2 nl der RNA bei 50 nM.
5. Expel RNA, spülen Nadel mit DEPC-H ₂ O, und laden neben RNA zur Injektion.

Teil 4: Oocyte Kultur

1. Legen Eizellen in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte (Sigma Aldrich). Wir Kultur bis zu tausend Eizellen pro Vertiefung.
2. Remove-Puffer und ersetzen mit 400 ul O ocyte C ulture M edium (OCM, siehe Material und Methoden) pro Vertiefung. Legen Kultur Platte innerhalb einer luftdichten Kunststoffbehälter mit nassen Papiertuch zu feuchte Umgebung während der Kultur aufrecht zu erhalten.
3. Inkubieren Oozyten bei 18 ° C für Zeitpunkten zwischen 8 und 48 Stunden.

Teil 5: Fixierung, Entwässerung und Lagerung von Eizellen

1. Sortieren jedes tote Eizellen und Ort überlebenden Oozyten in Glasflaschen. Wir routinemäßig beobachten> 90% Überleben.
2. Legen Eizellen in MEMFA Fixativ (siehe Materialien und Methoden) und Rock für 20 Minuten. Schützen Sie die Oozyten von Licht durch Abdecken mit Alufolie abdecken.
3. Wash-Oozyten durch Entfernen Fixiermittel und ersetzen mit gleichem Volumen MBSH Puffer. Wiederholen Sie diesen waschen noch einmal für insgesamt zwei Wäschen.
4. Wash Eizellen in wasserfreiem Methanol:
   1. Entfernen Sie die Hälfte des Volumens, mit Methanol zu ersetzen.
   2. Wiederholen Sie Schritt "a" zweimal.
   3. Entfernen Sie die gesamte Lösung, mit Methanol zu ersetzen.
   4. Wiederholen Methanol waschen.
5. Eizellen können bei -20 ° C gelagert werden, bis bereit zum Bild.

Teil 6: Imaging RNA Localization durch konfokale Mikroskopie

1. Vor Bildgebung, fügen Murray s Clearing Medium (2:1 Benzylbenzoat-Benzylalkohol) zu einem Glasboden FluoroDish (WPI Inc.) auf die Bildfläche zu decken.
2. Sorgfältig Transfer der Oozyten von Methanol zu FluoroDish, Minimierung des Volumens von Methanol übertragen.
3. Bild auf einer invertierten konfokalen Mikroskop (Wir haben erfolgreich ein Zeiss LSM510 und ein Leica TCS SP2 verwendet).

Abbildung 1:.. Visualisierung von subzelluläre RNA Localization durch Mikroinjektion von fluoreszierend markierten Transkripte A. Nach Mikroinjektion, RNA mit Alexa Fluor 546 gekennzeichnet ist zunächst auf den Kern beschränkt B. Nach acht Stunden der Kultur, kann eine fluoreszenzmarkierte Kontroll-RNA einheitlich gesehen werden verteilt in das Zytoplasma der Eizelle. C. Allerdings fluoreszenzmarkierte RNA Sequenzen enthält, die Rekrutierung der Transportmaschinen in den Prozess der subzellulären Lokalisation der vegetativen Pol der Eizelle (nach unten) zu sehen. Balken = 50 um.

Discussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Visualisierung von mRNA-Lokalisierung in Xenopus Oozyten vorgestellt. Diese Methode, mit fluoreszenzmarkierten RNA-Transkripte hat höheres Signal-Rausch-Verhältnis als bisher mit Digoxigenin-markierten Transkripte erhalten und ist einfacher und schneller als in-situ Ansätze (Mowry und Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Mit dieser Methode können wir Ingenieur-RNA-Sequenz Mutationen und schnell für die in vivo Funktion zu testen. Ferner kann durch die Verwendung zusätzlicher Alexa-UTP Fluorophore können mehrere RNA-Spezies in der gleichen Eizelle visualisiert werden. Wir haben festgestellt, dass in Xenopus Oozyten Alexa Fluor 546 bis 14-UTP bessere Ergebnisse liefert als mit Alexa Fluor 488 bis 5-UTP, weil der Autofluoreszenz in der 488 nm Wellenlängenbereich verglichen, jedoch ist Dual Imaging von zwei RNAs dennoch möglich (Gagnon und Mowry, 2009). Außerdem funktioniert diese Technik auch in Verbindung mit Immunfärbung Protokolle Protein Kolokalisation erkennen, wie eine Vielzahl von kompatiblen fluoreszierenden sekundären Antikörper verfügbar sind (Yoon und Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Schließlich können Störungen der RNA Lokalisierungsprozess durch Überexpression von dominant negative Faktoren oder kleines Molekül Interferenzen mit diesem Assay kombiniert werden, um subtile Defekte in der mRNA-Lokalisierung Weg (Messitt et al., 2008) zu visualisieren. Diese Technik hat sich als relativ einfach und robust Assay zum Nachweis von mRNA Verteilung in vivo und können problemlos in bestehende biochemische, molekular-und zellbiologische Techniken zur Untersuchung von Mechanismen der mRNA Transport integriert werden.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.