Visualizing शाही सेना स्थानीयकरण में Xenopus Oocytes

Summary

के विज़ुअलाइज़ेशन

Abstract

शाही सेना स्थानीयकरण सेल polarity की स्थापना के एक संरक्षित तंत्र है. Vg1 mRNA Xenopus laevis oocytes और spatially Vg1 प्रोटीन के जीन की अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए कार्य करता है की वनस्पति पोल localizes है. इस तरीके में Vg1 वितरण के चुस्त नियंत्रण विकासशील भ्रूण में उचित रोगाणु परत विनिर्देशन के लिए आवश्यक है. 3 'mRNA की UTR में शाही सेना अनुक्रम तत्वों, Vg1 स्थानीयकरण तत्व (VLE) की आवश्यकता है और सीधे परिवहन के लिए पर्याप्त हैं. और vivo में Vg1 mRNA की मान्यता परिवहन अध्ययन करने के लिए, हम एक इमेजिंग तकनीक है कि एक साधारण दृश्य readout के माध्यम से पार कारक निर्देशित परिवहन तंत्र के व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है विकसित किया है.

शाही सेना स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए, हम fluorescently लेबल VLE शाही सेना synthesize और व्यक्तिगत oocytes में इस प्रतिलेख microinject. Oocyte संस्कृति के बाद इंजेक्शन शाही सेना के परिवहन की अनुमति के लिए, oocytes तय की और निर्जलित पूर्व confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए कर रहे हैं. विज़ुअलाइज़ेशन mRNA स्थानीयकरण पैटर्न की शाही सेना के परिवहन की पूरी मार्ग की निगरानी के लिए और सीआईएस प्रतिलेख और ट्रांस अभिनय कारक है कि VLE (लुईस एट अल., 2008 के लिए बाध्य भीतर तत्वों अभिनय के लिए शाही सेना परिवहन निर्देशन में भूमिकाओं की पहचान के लिए एक readout प्रदान करता है Messitt एट अल, 2008). हम सह स्थानीयकरण के माध्यम से इस तकनीक बढ़ाया है अतिरिक्त RNAs और प्रोटीन (Gagnon और Mowry, 2009, Messitt एट अल., 2008) के साथ, और मोटर प्रोटीन के विघटन और cytoskeleton के साथ संयोजन में (Messitt एट अल, 2008) की जांच करने के लिए mRNA स्थानीयकरण अंतर्निहित तंत्र.

Protocol

भाग 1: fluorescently लेबल mRNA की ट्रांसक्रिप्शन.

1. प्लाज्मिड डीएनए शाही सेना स्थानीयकरण तत्व या अन्य प्रासंगिक अनुक्रम युक्त Linearize और DEPC का इलाज एच ₂ ओ के साथ एक μg / μl resuspend डीएनए टेम्पलेट T7, SP6, या T3 आरएनए पोलीमरेज़ प्रतिलेखन के लिए अपस्ट्रीम प्रमोटर साइटों होना चाहिए.
2. एक बाँझ 1.5mL ट्यूब निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें:

   ए 10X टीएक्स बफर (एम एंड एम)	2 μl
   ज. 20X टोपी / एनटीपी मिश्रण (एम एंड एम)	1 μl
   सी. 1 मिमी Alexa 546-14-UTP Fluor (Invitrogen)	1 μl
   मृ UTP, [α-32 पी] (1 μCi μl /) (Perkin एल्मर)	1 μl
   ई. DEPC - एच 2 हे	11 μl
   एफ 0.2 एम डीटीटी	1 μl
   जी RNasin (Promega)	1 μl
   एच. रैखिक टेम्पलेट डीएनए	1 μl
   i. शाही सेना पोलीमरेज़ (Promega)	1 μl

3. अभिकर्मकों धीरे मिक्स और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र (10 एक microcentrifuge में सेक).
4. 37 ° C पर 2-4 घंटे के लिए सेते हैं, एल्यूमीनियम पन्नी की fluorophore photobleaching को रोकने के साथ ट्यूब को कवर.
5. जोड़ें एक μl 1 मिलीग्राम / एमएल RNase मुक्त DNase (Promega) टेम्पलेट डीएनए नीचा.
6. 37 पर 15 मिनट सेते ° सी.
7. 79 μl 20 मिमी EDTA (8.0 पीएच) की प्रतिक्रिया को रोकने में जोड़ें.
8. एक अलग ट्यूब, "इनपुट" और बचाने के रूप में चिह्नित करने के लिए 1 μl निकालें.
9. एक 1 मिलीलीटर G50 स्तंभ के माध्यम से स्पिन प्रतिक्रिया (सामग्री और तरीके को देखें), जो अनिगमित nucleotides शामिल है, जबकि पूरी लंबाई mRNA छोड़कर.
10. इथेनॉल तेज़ी से शाही सेना का ध्यान:
    1. 250 μl 100% इथेनॉल, 10 μl दर्पण 7m _{3 ​​4} COONH, 1 μl वाहक आरएनए (खमीर tRNA, 10 / μg μl) या 1 μl ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
    2. अच्छी तरह मिक्स और ठोस -80 पर जब तक स्थिर डिग्री सेल्सियस> 30 मिनट के लिए या 15 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर.
    3. अधिकतम गति से 15 मिनट, छानना सतह पर तैरनेवाला के लिए microcentrifuge में घुमाओ.
    4. 75% इथेनॉल 150 μl के साथ धोएं.
    5. Microcentrifuge, छानना सतह पर तैरनेवाला में अधिकतम गति पर 3 मिनट के लिए स्पिन.
    6. 3 मिनट के लिए 37 पर गोली ° सी सूखी, यह सुनिश्चित करना कि सभी इथेनॉल हवा हो गया है.
11. 11 μl DEPC एच ₂ हे में Resuspend और एक अलग ट्यूब, "शामिल" के रूप में लेबल 1 μl हटायें.
12. प्रतिशत निर्धारित निगमन और 50 एनएम के लिए शाही सेना पतला (सामग्री और गणना के लिए तरीके देखें).
13. आरएनए 5 μl aliquots में जमे हुए किया जाना चाहिए, और एकल उपयोग के लिए फ्रीज / पिघलना चक्र से बचने के कई हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता

भाग 2: Microinjection के लिए तैयारी.

1. शाही सेना तैयार:
   शाही सेना (50 एनएम) के एक विभाज्य पहले गला लें, और 70 में शाही सेना denature ° C 3-5 मिनट के लिए. 10 मिनट के लिए कमरे में अधिकतम गति पर तापमान microcentrifuge में स्पिन किसी भी particulates निकालने के लिए, और बर्फ पर रख.
2. Oocyte तैयार:
   1. शल्य चिकित्सा Xenopus laevis महिलाओं (Nasco) से अंडाशय हटा दें.
   2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार Collagenase समाधान के 25 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में Xenopus laevis अंडाशय के छाँटो टुकड़े (सामग्री और तरीके को देखें) .
   3. धीरे 18 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए, हिलाओ या oocytes जब तक दिख अंडाशय से अलग हो रहे हैं. भिन्नता के लिए बैच बैच के कारण, collagenase इलाज समय भिन्न है और ध्यान से दृश्य निरीक्षण के माध्यम से निगरानी करनी चाहिए defoliculation सुनिश्चित हो सकता है.
   4. Oocytes ट्यूब में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, समाधान को हटाने और MBSH बफर के साथ oocytes धोने (सामग्री और तरीके को देखें).
   5. दोहराएँ तीन washes के एक कुल के लिए और अधिक दो बार धोने. यह oocyte अलगाव प्रोटोकॉल कि कोहेन एट अल. 2009 में विस्तृत करने के लिए इसी तरह की है.
   6. मैन्युअली सॉर्ट चरण MBSH बफर में / III, IV (Dumont, 1972) एक मानक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत oocytes. चरण III oocytes लेकिन पूरी तरह से अपारदर्शी सफेद होते हैं, जबकि चतुर्थ चरण oocytes थोड़ा बड़ा और वर्णक के साथ धब्बेदार हैं. कि थोड़ा पारदर्शी oocytes भी जवान और oocytes कि पूरी तरह pigmented या एक्ज़िबिट polarized वर्णक वितरण बहुत पुराने हैं.
3. सुई तैयार:
   खींचो और बेवेल ~ 0.05 मिमी की एक बाहरी व्यास के लिए सुई. (हम Drummond वैज्ञानिक 3.5 इंच capillaries का उपयोग करें (# 3-000-203-G क्रम / एक्स), Sutter साधन कं micropipette पेचकश और एक थोक मूल्य सूचकांक इंक beveller.)

भाग 3: Microinjection

1. DEPC एच ₂ हे के साथ सुई जांचना nl प्रति 2 इंजेक्शन देने के लिए . हम हमारे सुई सामने लोड एक गैस चालित microinjector (सामग्री और तरीके को देखें) का उपयोग, और ड्रॉप आकार का उपयोग कर एक micrometer जांचना.
2. सुई में शाही सेना लोड.
3. एक इंजेक्शन MBSH बफर युक्त पकवान प्लेस में oocytes हल. हम काले फोम रबर की एक परत के साथ एक डिश पर microinject. पीला oocytes अच्छी तरह से बाहर एक सफेद backgrou पर खड़ेएन डी.
4. ध्यान से शाही सेना के 2 nl के साथ 50 एनएम प्रत्येक oocyte इंजेक्षन.
5. शाही सेना, DEPC एच ₂ हे के साथ सुई, कुल्ला और इंजेक्शन के लिए अगले शाही सेना लोड निष्कासित .

भाग 4: Oocyte संस्कृति

1. एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली (सिग्मा Aldrich) की एक अच्छी तरह से में रखें oocytes. हम अच्छी तरह से प्रति एक हजार oocytes अप संस्कृति.
2. बफर निकालें और 400 μl हे ocyte सी ulture एम edium के साथ जगह (OCM, सामग्री और तरीके को देखने के) अच्छी तरह से प्रति. संस्कृति के दौरान नम वातावरण बनाए रखने के लिए गीले कागज तौलिया के साथ एक हवा तंग प्लास्टिक के कंटेनर के अंदर प्लेस संस्कृति की थाली.
3. 18 ° समय पर अंक 8 और 48 घंटे के बीच लेकर के लिए सी oocytes सेते हैं.

भाग 5: निर्धारण, और oocytes की निर्जलीकरण संग्रहण

1. बाहर किसी भी मर oocytes के आधार पर क्रमबद्ध और कांच की शीशियों में जीवित oocytes जगह. हम नियमित रूप से> 90% के अस्तित्व का निरीक्षण करते हैं.
2. MEMFA लगानेवाला (सामग्री और तरीके देखें) और 20 मिनट के लिए चट्टान में रखें oocytes. प्रकाश से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर द्वारा oocytes को सुरक्षित रखें.
3. लगानेवाला हटाने और MBSH बफर के बराबर मात्रा के साथ जगह oocytes धो लें. दो washes के एक कुल के लिए इस धोने के एक बार और दोहराएँ.
4. निर्जल मेथनॉल में oocytes धो:
   1. मात्रा का आधा निकालें, मेथनॉल के साथ की जगह.
   2. "एक" दो बार चरण को दोहराएँ.
   3. समाधान के सभी निकालें, मेथनॉल के साथ की जगह.
   4. मेथनॉल धोने दोहराएँ.
5. Oocytes -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता, जब तक छवि के लिए तैयार है.

भाग 6: इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा शाही सेना स्थानीयकरण

1. इमेजिंग से पहले एक गिलास नीचे FluoroDish (डब्ल्यूपीआई इंक) मूर्रे समाशोधन मध्यम (02:01 लोबान शराब बेंजोएट - लोबान) जोड़ने के लिए इमेजिंग सतह को कवर.
2. ध्यान से मेथनॉल से FluoroDish oocytes हस्तांतरण, मेथनॉल हस्तांतरित की मात्रा कम.
3. एक औंधा confocal खुर्दबीन पर छवि (हम सफलतापूर्वक एक Zeiss LSM510 और एक Leica टीसीएस SP2 का इस्तेमाल किया है).

चित्रा 1:.. Subcellular शाही सेना स्थानीयकरण के fluorescently लेबल टेप के Microinjection द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन ए के बाद microinjection, शाही सेना Alexa Fluor 546 के साथ लेबल शुरू नाभिक को प्रतिबंधित संस्कृति के आठ घंटे के बाद बी, fluorescently लेबल नियंत्रण शाही सेना समान देखा जा सकता है oocyte के cytoplasm में वितरित सी. हालांकि, fluorescently लेबल शाही सेना के दृश्यों कि परिवहन तंत्र की भर्ती युक्त oocyte (नीचे की ओर) के वनस्पति पोल करने के लिए subcellular स्थानीयकरण की प्रक्रिया में देखा जा सकता है . स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.

Discussion

यहाँ हम Xenopus oocytes में mRNA स्थानीयकरण दृश्यमान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. इस विधि, fluorescently लेबल शाही सेना टेप का उपयोग उच्च संकेत से शोर अनुपात करने के लिए पहले digoxigenin लेबल टेप के साथ प्राप्त की और सरल और यथास्थान आधारित दृष्टिकोण (Mowry और मेल्टन, 1992, Gautreau एट अल, 1997) की तुलना में तेजी है. इस पद्धति का उपयोग करके, हम इंजीनियर अनुक्रम म्यूटेशनों शाही सेना और तेजी से vivo समारोह में के लिए परीक्षण कर सकते हैं. इसके अलावा, अतिरिक्त Alexa UTP fluorophores का उपयोग करके, एकाधिक आरएनए प्रजातियों ही oocyte में visualized किया जा सकता है. हमने पाया है कि Xenopus oocytes Alexa Fluor 546-14-UTP Alexa 488 5 UTP Fluor 488 एनएम तरंगदैर्ध्य रेंज में autofluorescence के कारण के साथ तुलना के रूप में बेहतर परिणाम देता है, तथापि, दो RNAs के दोहरे इमेजिंग फिर भी संभव है (Gagnon और , 2009) Mowry. इसके अलावा, इस तकनीक immunostaining करने के लिए प्रोटीन colocalization का पता लगाने के प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में अच्छी तरह से काम करता है, संगत फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी की एक विस्तृत विविधता के रूप में उपलब्ध हैं (Yoon और Mowry, 2006, Messitt एट अल., 2008). अंत में, प्रमुख नकारात्मक कारकों या छोटे अणु हस्तक्षेप की अभिव्यक्ति के माध्यम से शाही सेना स्थानीयकरण प्रक्रिया के विघटन इस परख के साथ जोड़ा जा mRNA स्थानीयकरण मार्ग में सूक्ष्म दोषों (Messitt एट अल., 2008) कल्पना कर सकते हैं. इस तकनीक के vivo में mRNA वितरण का पता लगाने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और मजबूत परख साबित हो गया है और आसानी से मौजूदा जैव रासायनिक, mRNA परिवहन तंत्र की जांच के लिए आणविक और सेल जैविक तकनीक में एकीकृत किया जा सकता है.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.