Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

Summary

Visualizzazione di

Abstract

Localizzazione dell'RNA è un meccanismo conservato di stabilire la polarità delle cellule. Vg1 mRNA localizza al polo vegetale ovociti di Xenopus laevis e atti a limitare spazialmente l'espressione genica di VG1 proteine. Stretto controllo VG1 distribuzione in questo modo è richiesto per l'indicazione corretta foglietto embrionale di un embrione in via di sviluppo. Elementi di sequenza di RNA nel 3 'UTR del mRNA, il VG1 elemento di localizzazione (VLE) sono necessari e sufficienti per trasporto diretto. Per studiare il riconoscimento e il trasporto del VG1 mRNA in vivo, abbiamo sviluppato una tecnica di imaging che permette un'analisi approfondita dei trans-fattore di meccanismi di trasporto diretto attraverso una semplice lettura visiva.

Per visualizzare la localizzazione di RNA, che sintetizzano fluorescente RNA VLE e microinject questa trascrizione in ovociti individuali. Dopo la cultura degli ovociti per consentire il trasporto del RNA iniettato, gli ovociti vengono fissate e disidratate prima di imaging, microscopia confocale. Visualizzazione di modelli di localizzazione mRNA fornisce una lettura per il monitoraggio del percorso completo di RNA di trasporto e per l'individuazione dei ruoli nel dirigere l'RNA di trasporto per cis-acting elementi all'interno della trascrizione e trans-acting fattori che si legano al VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Abbiamo esteso questa tecnica attraverso la co-localizzazione di RNA e proteine ​​addizionali (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e in combinazione con la rottura del motore e di proteine ​​del citoscheletro (Messitt et al., 2008) di sondare meccanismi alla base di localizzazione mRNA.

Protocol

Parte 1: Trascrizione di mRNA fluorescente.

1. Linearizzare DNA plasmidico contenente l'elemento di localizzazione di RNA o altre sequenze pertinenti e risospendere a 1 mg / mL con DEPC trattati con H ₂ O. Il modello di DNA deve avere siti promotore a monte per la trascrizione da T7, SP6, o T3 RNA polimerasi.
2. Aggiungere i seguenti reagenti in una provetta sterile 1,5 ml:

   a. Tx tampone 10X (vedi M & M)	2 microlitri
   b. 20X tappo / NTP mix (vedi M & M)	1 ml
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 ml
   d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / mL) (Perkin Elmer)	1 ml
   e. DEPC-H 2 O	11 microlitri
   f. 0,2 M DTT	1 ml
   g. RNasin (Promega)	1 ml
   h. modello di DNA lineare	1 ml
   i. RNA polimerasi (Promega)	1 ml

3. Mescolare delicatamente i reagenti e centrifugare brevemente (10 sec. In una microcentrifuga).
4. Incubare per 2-4 ore a 37 ° C, coprendo il tubo con un foglio di alluminio per evitare photobleaching di fluoroforo.
5. Aggiungere 1 ml a 1 mg / ml RNasi-free DNasi (Promega) a degradare DNA stampo.
6. Incubare 15 minuti a 37 ° C.
7. Aggiungere 79 microlitri 20 mM EDTA (pH 8,0) per arrestare la reazione.
8. Togliere 1 ml ad un tubo separato, etichettato come "input" e salvare.
9. Spin reazione attraverso un G50 colonna 1 ml (vedi Materiali e Metodi), che includerà nucleotidi prive di personalità giuridica, escludendo l'mRNA pieno lunghezza.
10. Concentrare l'RNA per precipitazione dell'etanolo:
    1. Aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100%, 10 microlitri 7M CH ₃ COONH _4, 1 ml vettore RNA (tRNA di lievito, 10 mg / mL) o 1 glicogeno microlitri (20 mg / ml).
    2. Mescolare bene e congelare fino solido a -80 ° C per> 30 minuti o in ghiaccio secco per 15 minuti.
    3. Girare alla massima velocità in microcentrifuga per 15 minuti, il surnatante decantare.
    4. Lavare con 150 ml di etanolo 75%.
    5. Spin per 3 minuti a velocità massima in microcentrifuga, sopranatante decantare.
    6. Asciugare il pellet a 37 ° C per 3 minuti, assicurando che tutti i etanolo è evaporato.
11. Risospendere in 11 microlitri DEPC-H ₂ O e togliere 1 ml ad un tubo separato, etichettato come "incorporati".
12. Determinare l'incorporazione per cento e diluire l'RNA a 50 Nm (vedi Materiali e Metodi di calcolo).
13. L'RNA devono essere congelati in 5 aliquote microlitri, ad uso singolo per evitare cicli gelo / disgelo e può essere conservato per diverse settimane a -80 ° C.

Parte 2: Preparazione per microiniezione.

1. RNA Preparazione:
   Scongelare una aliquota di RNA (50 nm) e denaturare l'RNA a 70 ° C per 3-5 minuti. Spin per 10 minuti in microcentrifuga temperatura ambiente alla massima velocità per rimuovere qualsiasi particelle, e tenere in ghiaccio.
2. Ovocita Preparazione:
   1. Rimuovere chirurgicamente ovaie da femmine Xenopus laevis (Nasco).
   2. Pezzi speciali di ovaio Xenopus laevis in una provetta da 50 ml contenente 25 ml di soluzione Collagenasi (vedi Materiali e Metodi).
   3. Agitare delicatamente a 18 ° C per 15 minuti, o fino a quando gli ovociti sono visibilmente separati da ovaio. A causa di variazione tra le partite, tempo di trattamento collagenasi può variare e devono essere monitorati attentamente un'ispezione visuale per assicurare defoliculation.
   4. Lasciare ovociti a stabilirsi in tubo, rimuovere la soluzione e lavare gli ovociti con tampone MBSH (vedi Materiali e Metodi).
   5. Ripetere il lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi. Questo protocollo isolamento degli ovociti è simile a quella dettagliata Cohen et al., 2009.
   6. Manualmente sorta di stadio III / IV ovociti (Dumont, 1972) nel buffer MBSH al microscopio standard di dissezione. Ovociti stadio III sono completamente opache, ma bianco, mentre gli ovociti stadio IV, sono leggermente più grandi e punteggiato di pigmento. Ovociti che sono leggermente trasparenti sono troppo giovani e ovociti che completamente pigmentate o distribuzione del pigmento mostra polarizzati sono troppo vecchio.
3. Ago Preparazione:
   Tirare e smusso aghi di un diametro esterno di circa 0,05 mm. (Utilizziamo Drummond scientifico capillari da 3,5 pollici (per n. 3-000-203-G / X), uno strumento Sutter Co. micropipetta estrattore e un WPI Inc. beveller.)

Parte 3: Microiniezione

1. Calibrare ago con DEPC-H ₂ O per erogare 2 nl per iniezione. Siamo davanti carico nostro ago usando un gas-driven microinjector (vedi Materiali e Metodi), e calibrare dimensioni di caduta con un micrometro.
2. Carico RNA in ago.
3. Luogo ordinati ovociti in un piatto di iniezione contenente tampone MBSH. Noi microinject su un piatto con uno strato di gommapiuma nero. Gli ovociti pallido risaltare su un backgrou biancond.
4. Con attenzione iniettare ogni ovocita con 2 nl di RNA a 50 nm.
5. Espellere l'RNA, lavare ago con DEPC-H ₂ O, e carico di RNA prossimo per l'iniezione.

Parte 4: Cultura ovociti

1. Ovociti posto in un pozzetto di una sterile 24 pozzetti (Sigma Aldrich). Ci cultura fino a mille ovociti per pozzetto.
2. Eliminare la soluzione tampone e sostituire con 400 microlitri O M C ultura ocyte edium (OCM, vedi Materiali e Metodi) per bene. Luogo piastra di coltura all'interno di un contenitore a tenuta stagna in plastica con un tovagliolo di carta umido per mantenere l'ambiente umido durante cultura.
3. Incubare ovociti a 18 ° C per intervalli di tempo compresi tra 8 e 48 ore.

Parte 5: fissazione, disidratazione e conservazione degli ovociti

1. Risolvere eventuali ovociti morti e il luogo ovociti sopravvissuti in flaconcini di vetro. Noi abitualmente osserviamo sopravvivenza> 90%.
2. Ovociti posto in MEMFA fissativo (vedi Materiali e Metodi) e rock per 20 minuti. Proteggere gli ovociti dalla luce coprendo con un foglio di alluminio.
3. Lavare ovociti rimuovendo fissativo e la sostituzione con uguale volume di tampone MBSH. Ripetere questa lavare una volta di più per un totale di due lavaggi.
4. Lavare gli ovociti in metanolo anidro:
   1. Rimuovere la metà del volume, sostituire con metanolo.
   2. Ripetere il punto "a" due volte.
   3. Rimuovere tutta la soluzione, sostituire con metanolo.
   4. Ripetere il lavaggio metanolo.
5. Ovociti possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di immagine.

Parte 6: Imaging localizzazione di RNA di microscopia confocale

1. Prima di immagini, aggiungere Media Clearing Murray s (2:1 benzil benzoato-benzil alcool) ad un FluoroDish fondo di vetro (WPI Inc.) per coprire la superficie di imaging.
2. Trasferire accuratamente l'ovociti da metanolo a FluoroDish, riducendo al minimo il volume di metanolo trasferiti.
3. Immagine su un microscopio invertito confocale (Abbiamo utilizzato con successo un LSM510 Zeiss e di una Leica TCS SP2).

Figura 1:.. Visualizzazione di localizzazione subcellulare RNA Microiniezione di trascrizioni fluorescente Etichettato microiniezione A. In seguito, l'RNA marcato con Alexa Fluor 546 è inizialmente limitato al nucleo B. Dopo otto ore di cultura, un RNA fluorescente di controllo può essere visto in modo uniforme distribuito nel citoplasma dell'ovocita. C. Tuttavia, l'RNA fluorescente contenente sequenze che reclutano i macchinari di trasporto può essere visto nel processo di localizzazione subcellulare al polo vegetale dell'ovocita (verso il basso). Barra di scala = 50 micron.

Discussion

Qui abbiamo presentato un protocollo per visualizzare la localizzazione mRNA in ovociti di Xenopus. Questo metodo, utilizzando fluorescente trascrizioni di RNA è più alto rapporto segnale-rumore di quanto precedentemente ottenuti con marcati con digossigenina trascrizioni ed è più semplice e più veloce di approcci basati in situ (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Utilizzando questo metodo, possiamo progettare mutazioni sequenza di RNA e rapidamente test per funzione in vivo. Inoltre, utilizzando ulteriori Alexa-UTP fluorofori, più specie di RNA possono essere visualizzati nell'ovocita stesso. Abbiamo scoperto che in ovociti di Xenopus Alexa Fluor 546-14-UTP dà risultati superiori in confronto con Alexa Fluor 488-5-UTP a causa di autofluorescenza nella gamma di lunghezze d'onda 488 nm, tuttavia, l'imaging a doppia di due RNA è comunque possibile (Gagnon e Mowry, 2009). Inoltre, questa tecnica funziona bene in combinazione con protocolli di immunoistochimica per rilevare colocalizzazione proteine, come una grande varietà di anticorpi fluorescenti compatibile secondari sono disponibili (Yoon e Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Infine, l'interruzione del processo di localizzazione di RNA attraverso sovra-espressione di fattori negativi dominanti o interferenze piccola molecola può essere combinato con questa analisi di visualizzare i difetti sottili nel percorso di localizzazione mRNA (Messitt et al., 2008). Questa tecnica ha dimostrato di essere un test relativamente semplice e robusto per la rilevazione di distribuzione mRNA in vivo e può essere integrato facilmente in esistenti biochimiche, tecniche di biologia molecolare e biologia cellulare per sondare i meccanismi di trasporto mRNA.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.