Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

Summary

Визуализация

Abstract

РНК локализация сохраняется механизм формирования клеточной полярности. Vg1 мРНК локализуется на растительном полюса Xenopus laevis ооциты и действует на пространственно ограничить экспрессии генов Vg1 белка. Жесткий контроль Vg1 распределение таким образом, необходимо для правильного выбора слой зародыша в развивающемся эмбрионе. РНК последовательности элементов в 3 'UTR мРНК, Vg1 локализации элемента (VLE) необходимы и достаточны для прямого транспорта. Для изучения признание и транспортировки Vg1 мРНК в естественных условиях, мы разработали изображений метод, который позволяет обширный анализ транс-фактора направлено транспортных механизмов с помощью простого визуального считывания.

Чтобы визуализировать локализацию РНК, мы синтезировать флуоресцентно меченных VLE РНК и microinject эту стенограмму в отдельные ооциты. После ооцитов культуры, чтобы перевозки вводили РНК, ооциты являются фиксированными и обезвоженные до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация модели локализации мРНК обеспечивает считывание для мониторинга полный путь РНК транспорта и для выявления роли в управлении РНК транспорта для цис-действующих элементов в стенограмме и транс-действующих факторов, которые связываются с VLE (Lewis и соавт., 2008, Messitt и соавт., 2008). Мы расширили эту технику в рамках совместного с дополнительной локализации РНК и белков (Ганьон и Моури, 2009, Messitt и соавт., 2008), а в сочетании с нарушением моторных белков и цитоскелет (Messitt и соавт., 2008), чтобы исследовать механизмы, лежащие мРНК локализации.

Protocol

Часть 1: Транскрипция флуоресцентно меченных мРНК.

1. Линеаризации плазмиды ДНК, содержащей элемент РНК локализации или другие соответствующие последовательности и ресуспендирования на 1 мкг / мкл DEPC обработанных H ₂ O. ДНК шаблоне должен быть выше по течению сайтов промотор для транскрипции Т7, SP6, или T3 РНК-полимеразы.
2. Добавить следующие реагенты для стерильного 1,5 мл трубки:

   a. 10X Tx буфере (см. М & М)	2 мкл
   b. 20X шапка / NTP смеси (см. М & М)	1 мкл
   c. 1 мМ Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 мкл
   d. UTP, [α-32 P] (1 мкКи / мкл) (Perkin Elmer)	1 мкл
   e. DEPC-H 2 O	11 мкл
   f. 0,2 М ДТТ	1 мкл
   g. RNasin (Promega)	1 мкл
   час линейная ДНК-матрицы	1 мкл
   i. РНК-полимеразы (Promega)	1 мкл

3. Смешайте реагенты мягко и центрифуга кратко (10 сек. В микроцентрифужных).
4. Инкубируйте в течение 2-4 часов при 37 ° C, покрытие трубы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивания флуорофора.
5. Добавить 1 мкл 1 мг / мл РНКазы без ДНКазы (Promega) деградировать шаблона ДНК.
6. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
7. Добавить 79 мкл 20 мМ ЭДТА (рН 8,0), чтобы остановить реакцию.
8. Удалить 1 мкл в отдельную трубу, помеченные как "вход" и сохранить.
9. Спиновые реакции через 1 мл G50 колонке (см. Материалы и методы), который будет включать неинкорпорированных нуклеотиды, исключая полное мРНК длиной.
10. Концентрат РНК этанолом осадков:
    1. Добавьте 250 мкл 100% этанола, 10 мкл 7М CH ₃ COONH _4, 1 мкл носителя РНК (тРНК дрожжей, 10 мкг / мкл) или 1 мкл гликогена (20 мг / мл).
    2. Хорошо перемешать и заморозить до твердого при -80 ° С в течение> 30 минут или на сухом льду в течение 15 минут.
    3. Спиновые на максимальной скорости в микроцентрифужных течение 15 минут, сцедить супернатант.
    4. Промыть 150 мкл 75% этанола.
    5. Спиновые в течение 3 минут при максимальной скорости в микроцентрифужных, переливать супернатант.
    6. Сухие гранулы при температуре 37 ° С в течение 3 минут, чтобы все этанола не испарится.
11. Ресуспендируют в 11 мкл DEPC-H ₂ O и удалить 1 мкл до отдельной трубки, помеченные как "включено".
12. Определить процент включения и разбавленных РНК до 50 нм (см. Материалы и методы расчета).
13. РНК должны быть заморожены в 5 мкл аликвот, для одноразового использования, чтобы избежать циклов замораживания / оттаивания и может храниться в течение нескольких недель при температуре -80 ° C.

Часть 2: Подготовка к Микроинъекция.

1. РНК приготовления:
   Оттепель аликвоту РНК (50 нм) и денатурации РНК при 70 ° С в течение 3-5 минут. Спиновые в течение 10 минут при комнатной температуре микроцентрифужных на максимальной скорости, чтобы удалить твердые частицы, и держать на льду.
2. Подготовка ооцитов:
   1. Хирургическим путем удалить яичники из Xenopus laevis женщин (НАСКО).
   2. Обрезать куски яичников Xenopus laevis в 50 мл коническую пробирку с 25 мл коллагеназы решения (см. Материалы и Методы).
   3. Встряска мягко при 18 ° С в течение 15 минут, или пока ооцитов заметно отделен от яичника. Из-за партии к партии вариации, коллагеназы время лечения может варьироваться и должны находиться под тщательным наблюдением через визуальный осмотр с целью обеспечения defoliculation.
   4. Разрешить ооцитов, чтобы обосноваться в трубу, удалить раствор и промыть ооциты с буфером MBSH (см. Материалы и Методы).
   5. Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок. Этот протокол ооцитов изоляции аналогичен подробно изложены в Cohen и соавт., 2009.
   6. Вручную рода этап III / IV ооцитов (Дюмон, 1972) в MBSH буфера при стандартных рассекает микроскопом. Стадия III ооцитов полностью непрозрачны, но белый, в то время этапа IV ооцитов чуть больше, и с крапинами с пигментом. Ооцитов, которые немного прозрачной слишком молоды и ооцитов, которые полностью пигментированные или выставлять поляризованным распределением пигмента слишком стары.
3. Иглы Способ приготовления:
   Вытяните и конические иглы наружный диаметр ~ 0,05 мм. (Мы используем Драммонд Научно 3,5-дюймовый капилляров (приказ № 3-000-203-G / X), инструмент Саттер Ко микропипетки съемник и WPI Инк beveller.)

Часть 3: Микроинъекция

1. Калибровка игла с DEPC-H ₂ O для доставки 2 п на инъекцию. Мы нагрузка на переднюю нашей иглу использованием газа управляемой microinjector (см. Материалы и методы), и калибровки падение размера с помощью микрометра.
2. Нагрузка РНК в иглу.
3. Место отсортированы ооцитов в инъекции блюдо с MBSH буфера. Мы microinject на блюдо слой черного поролона. Бледно ооцитов выделяются также на белом backgrouй.
4. Внимательно вводить каждый ооцит с 2 п РНК при 50 нМ.
5. Выгнать РНК, промойте иглу с DEPC-H ₂ O, и загрузить следующий РНК для инъекций.

Часть 4: ооцитов культуры

1. Место ооцитов в скважине стерильные 24-луночного планшета (Sigma Aldrich). Мы культуры до тысячи яйцеклеток на лунку.
2. Удалить буфера и заменить 400 мкл О ocyte C ulture М edium (ОСМ, см. Материалы и методы) на лунку. Место культуры пластины внутри герметичный пластиковый контейнер с мокрым бумажным полотенцем, чтобы сохранить влажную среду во время культуры.
3. Инкубируйте ооцитов при 18 ° С в течение временных точках в диапазоне от 8 до 48 часов.

Часть 5: фиксация, обезвоживания и хранения ооцитов

1. Сортировать любые мертвые ооцитов и место выживших ооцитов в стеклянных флаконах. Мы регулярно наблюдаем> 90% выживаемости.
2. Место ооцитов в MEMFA фиксатором (см. Материалы и методы) и рок-течение 20 минут. Защита ооцитов от света, покрывая с алюминиевой фольгой.
3. Вымойте ооцитов путем удаления фиксатора и замена с равным объемом MBSH буфера. Повторите это еще раз мыть в общей сложности два стирок.
4. Вымойте ооцитов в безводном метаноле:
   1. Удаление половины объема, заменить метанол.
   2. Повторите шаг "" в два раза.
   3. Удалите все решения, заменить метанол.
   4. Повторите метанола стирки.
5. Ооциты могут храниться при температуре -20 ° С до готовности изображения.

Часть 6: Локализация РНК изображений с помощью конфокальной микроскопии

1. Перед изображения, добавлять Клиринговый Средний Мюррей ы (2:1 бензилбензоата-бензилового спирта), чтобы FluoroDish стеклянным дном (WPI Inc) для покрытия изображения поверхности.
2. Тщательно передачи ооцитов из метанола, FluoroDish, сводя к минимуму объем метанола переданы.
3. Изображение на перевернутую конфокальной микроскопии (Мы успешно использовали Zeiss LSM510 и Leica TCS SP2).

Рисунок 1:.. Визуализация субклеточных Локализация РНК Микроинъекция флуоресцентно меченых стенограммы А. После микроинъекции, РНК помечена Alexa Fluor 546 изначально ограничен ядром В. После восьми часов культуры, флуоресцентно меченных контроль РНК можно увидеть равномерно распространяется в цитоплазме яйцеклетки. C. Однако, флуоресцентно меченой РНК содержащие последовательности, которые вербуют транспортного машиностроения можно увидеть в процессе внутриклеточной локализации растительного полюса яйцеклетки (в направлении снизу). Шкала бар = 50 мкм.

Discussion

Здесь мы представили протокол для визуализации локализации мРНК в ооцитах Xenopus. Этот метод, с помощью флуоресцентно меченных РНК-транскрипты имеет более высокое отношение сигнал-шум, чем ранее полученные с дигоксигенин меченных стенограммы и проще, и быстрее, чем на месте подход (Моури и Мелтон, 1992, Гаутро и соавт., 1997). Используя этот метод, мы можем инженер РНК последовательности мутаций и быстрого теста для прижизненного функции. Кроме того, с помощью дополнительных Alexa-UTP флуорофоров, несколько видов РНК могут быть визуализированы в той же яйцеклетки. Мы обнаружили, что в ооцитах Xenopus Alexa Fluor 546-14-UTP дает превосходные результаты по сравнению с Alexa Fluor 488-5-UTP из-за флуоресценции в диапазоне длин волн 488 нм, однако, два изображения из двух РНК, тем не менее возможно (и Ганьон Моури, 2009). Кроме того, эта техника хорошо работает в сочетании с иммунной протоколов для обнаружения белка колокализации, а широкий спектр совместимых флуоресцентные вторичными антителами доступны (Yoon и Моури, 2006, Messitt и соавт., 2008). Наконец, нарушение процесса локализации РНК вследствие чрезмерного выражения доминирующих негативных факторов или небольшие помехи молекулы могут быть объединены с этого теста для визуализации тонких дефектов в пути локализации мРНК (Messitt и соавт., 2008). Эта техника оказалась относительно простой и надежный тест для обнаружения мРНК распределения в естественных условиях и может быть легко интегрирован в существующие биохимические, молекулярные и клеточные биологические методы для исследования механизмов мРНК транспорта.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.