Visualisera RNA lokalisering i Xenopus Oocyter

Summary

Visualisering av

Abstract

RNA lokalisering är en bevarad mekanism upprättandet cellens polaritet. Vg1 mRNA lokaliserar till växt-polen Xenopus laevis ägg och agerar för att rumsligt begränsa genuttryck av Vg1 protein. Noggrann kontroll av Vg1 fördelning på detta sätt krävs för korrekt grodden lagret specifikationen i det växande embryot. RNA-sekvens element i 3 'UTR av mRNA, den Vg1 lokalisering element (VLE) krävs och tillräckliga för direkt transport. Att studera erkännande och transport av Vg1 mRNA in vivo, har vi utvecklat en bildteknik som gör omfattande analys av trans-faktor riktad transportmekanismer via en enkel visuell avläsning.

Att visualisera RNA lokalisering, syntetisera vi fluorescerande VLE RNA och microinject denna utskrift i enskilda oocyter. Efter äggcellen kultur att tillåta transporten av det injicerade RNA, äggceller är fasta och uttorkade innan avbildning av konfokalmikroskopi. Visualisering av mönster mRNA lokalisering ger en avläsning för kontroll hela vägen av RNA transport och för att identifiera roller i regi RNA transport för cis-verkande element i avskriften och trans-verkande faktorer som binder till VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Vi har utvidgat denna teknik genom samarbete lokalisering med ytterligare RNA och proteiner (Gagnon och Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), och i kombination med störningar av motoriska proteiner och cytoskelettet (Messitt et al., 2008) att undersöka mekanismerna bakom mRNA lokalisering.

Protocol

Del 1: Transkribering av fluorescerande mRNA.

1. Linjärisera plasmid-DNA som innehåller RNA lokalisering element eller andra relevanta sekvens och resuspendera vid 1 mikrogram / ​​l med DEPC-behandlade H ₂ O. Den DNA-mall måste ha uppströms promotor platser för transkription av T7, SP6, eller T3 RNA-polymeras.
2. Lägg till följande reagenser till en steril 1,5 mL rör:

   A. 10X Tx buffert (se M & M)	2 l
   b. 20X keps / NTP mix (se M & M)	1 l
   C. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 l
   D. UTP, [α-32 P] (1 μCi / l) (Perkin Elmer)	1 l
   e. DEPC-H 2 O	11 l
   F. 0,2 M DTT	1 l
   g. RNasin (Promega)	1 l
   h. linjära mall DNA	1 l
   i. RNA-polymeras (Promega)	1 l

3. Blanda reagens försiktigt och centrifugera kort (10 sek. I mikrocentrifug).
4. Inkubera i 2-4 timmar vid 37 ° C, som täcker röret med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning av fluoroforen.
5. Tillsätt 1 l 1 mg / ml RNase-fria DNas (Promega) att brytas ned mallen DNA.
6. Inkubera 15 minuter vid 37 ° C.
7. Tillsätt 79 l 20 mM EDTA (pH 8,0) för att stoppa reaktionen.
8. Ta bort 1 l till ett separat rör, betecknas som "input" och spara.
9. Spin reaktion genom en 1 ml G50 kolumn (se Material & Metoder), som kommer att inkludera personliga nukleotider medan exklusive full längd mRNA.
10. Koncentrera RNA av etanol nederbörd:
    1. Tillsätt 250 l 100% etanol, 10 l 7M CH ₃ COONH _4, 1 l bärare RNA (tRNA jäst, 10 mikrogram / ​​l) eller 1 l glykogen (20 mg / ml).
    2. Blanda väl och frysa tills fast vid -80 ° C i> 30 minuter eller på torr is i 15 minuter.
    3. Spin vid maximal hastighet i mikrocentrifug i 15 minuter, dekantera supernatanten.
    4. Tvätta med 150 l av 75% etanol.
    5. Spin i 3 minuter vid maximal hastighet i mikrocentrifug, dekantera supernatanten.
    6. Torka pellets vid 37 ° C i 3 minuter, se till att alla etanol har avdunstat.
11. Resuspendera i 11 l DEPC-H ₂ O och ta bort 1 l till ett separat rör, märkta som "ingår".
12. Bestäm procent införlivandet och späd RNA till 50 Nm (se Material & Metoder för beräkning).
13. RNA bör frysas i 5 l portioner, för enskilt bruk för att undvika frys / tö cykler och kan lagras i flera veckor vid -80 ° C.

Del 2: Förberedelser för mikroinjektion.

1. RNA Förberedelser:
   Tina en alikvot av RNA (50 nM) och denaturera RNA vid 70 ° C i 3-5 minuter. Spin i 10 minuter i rumstemperatur mikrocentrifug vid maximal hastighet för att avlägsna partiklar, och hålla på is.
2. Äggcellen Förberedelser:
   1. Kirurgiskt ta bort äggstockarna från Xenopus laevis honor (NASCO).
   2. Trimma bitar av Xenopus laevis äggstock i ett 50 ml koniskt rör som innehåller 25 ml kollagenas lösning (se Material och metoder).
   3. Skaka försiktigt vid 18 ° C i 15 minuter, eller tills oocyter är synligt åtskilda från äggstocken. På grund av variation mellan tillverkningspartier kan kollagenas behandlingstiden varierar och bör övervakas noga genom visuell inspektion för att se defoliculation.
   4. Låt oocyter att bosätta sig i röret, ta bort lösningen och tvätta oocyter med MBSH buffert (se Material och metoder).
   5. Upprepa tvätta ytterligare två gånger för sammanlagt tre tvättar. Denna äggcell isolering protokoll liknar den som beskrivs i Cohen et al. 2009.
   6. Manuellt sortera stadium III / IV oocyter (Dumont, 1972) i MBSH buffert under en standard dissekera mikroskop. Steg III oocyter är helt ogenomskinliga, men vit, medan stadium IV oocyter är något större och spräcklig med pigment. Oocyter som är något genomskinliga är för ung och oocyter som helt pigmenterade eller uppvisar polariserade pigment distribution är för gammal.
3. Nål Förberedelser:
   Dra och avfasning nålar till en yttre diameter på ~ 0,05 mm. (Vi använder Drummond Vetenskapliga 3,5 tums kapillärer (För # 3-000-203-G / X), en Sutter Instrument Co mikropipett avdragare och en WPI Inc. beveller.)

Del 3: mikroinjektion

1. Kalibrera nålen DEPC-H ₂ O att leverera 2 NL per injektion. Vi lastar framför våra nål med en gasdriven microinjector (se Material & Metoder) och kalibrera droppstorlek med hjälp av en mikrometer.
2. Ladda RNA till nål.
3. Placera sorteras oocyter till en injektion maträtt som innehåller MBSH buffert. Vi microinject på ett fat med ett lager av svart skumgummi. Den bleka oocyter klart framträder på en vit backgrouND.
4. Noggrant Injicera varje äggcell med 2 NL av RNA vid 50 nm.
5. Utvisa RNA, skölj nålen DEPC-H ₂ O, och ladda nästa RNA för injektion.

Del 4: Oocyte Kultur

1. Placera ägg i en brunn i en steril 24 brunnar (Sigma Aldrich). Vi kulturen upp till tusen ägg per brunn.
2. Ta bort buffert och ersätt med 400 l O ocyte C KULTUR M edium (EKR, se Material & Metoder) per brunn. Placera odlingsplatta inuti en lufttät plastbehållare med våt pappershandduk för att bibehålla fuktig miljö under kultur.
3. Inkubera oocyter vid 18 ° C under tidpunkter på mellan 8 och 48 timmar.

Del 5: Fixering, dehydrering och lagring av oocyter

1. Reda ut alla döda äggceller och placera överlevande ägg i injektionsflaskor av glas. Vi följer rutinmässigt> 90% överlevnad.
2. Placera ägg i MEMFA fixativ (se Material & Metoder) och rock i 20 minuter. Skydda ägg från ljuset genom att täcka med aluminiumfolie.
3. Tvätta oocyter genom att ta bort fixativ och ersätts med lika stor volym MBSH buffert. Upprepa detta tvätta en gång i sammanlagt två tvättar.
4. Tvätta oocyter i vattenfri metanol:
   1. Ta bort hälften av volymen, byt med metanol.
   2. Upprepa steg "ett" två gånger.
   3. Ta bort alla av lösningen, ersätt med metanol.
   4. Upprepa metanol tvätt.
5. Oocyter kan lagras vid -20 ° C tills den ska bilden.

Del 6: Imaging RNA Lokalisering av konfokalmikroskopi

1. Innan bildbehandling, lägga Murray s Clearing Medium (2:1 bensylbensoat-bensylalkohol) till ett glas botten FluoroDish (WPI Inc.) för att täcka bildyta.
2. Försiktigt flytta ägg från metanol till FluoroDish, vilket minimerar mängden metanol överförs.
3. Bilden på ett inverterat konfokalmikroskop (Vi har framgångsrikt använt en Zeiss LSM510 och en Leica TCS SP2).

Figur 1:.. Visualisering av subcellulära RNA Lokalisering genom mikroinjektion av fluorescerande Märkta Avskrifter A. Efter mikroinjektion, RNA märkta med Alexa Fluor 546 initialt är begränsad till kärnan Efter åtta timmars kultur B., kan en fluorescerande kontroll RNA ses jämnt fördelade i cytoplasman i äggcellen. C. Däremot kan fluorescerande RNA som innehåller sekvenser som rekryterar transporten maskiner ses i färd med subcellulära lokalisering till vegetabiliska pol äggcellen (mot botten). Skala bar = 50 ìm.

Discussion

Här har vi lagt fram ett protokoll för visualisering av mRNA lokalisering i Xenopus oocyter. Denna metod, med hjälp av fluorescerande RNA-transkript har högre signal-brus-förhållande än vad som tidigare uppnåtts med digoxigenin märkt studieintyg och är enklare och snabbare än in-situ ansatser (Mowry och Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Med denna metod kan vi ingenjör RNA-sekvens mutationer och snabbt testa för in vivo-funktionen. Vidare genom att använda ytterligare Alexa-UTP fluoroforer kan flera RNA-arter visualiseras i samma äggcellen. Vi har funnit att i Xenopus oocyter Alexa Fluor 546-14-UTP ger överlägsna resultat jämfört med Alexa Fluor 488-5-UTP grund av autofluorescens i 488 nm våglängdsområde, men det är dubbla avbildning av två RNA ändå möjligt (Gagnon och Mowry, 2009). Dessutom fungerar denna teknik bra tillsammans med immunfärgning protokoll för att upptäcka protein colocalization, som ett brett utbud av kompatibla fluorescerande sekundära antikroppar finns tillgängliga (Yoon och Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Slutligen kan störning av RNA lokaliseringsprocessen genom över-uttryck av dominerande negativa faktorer eller liten molekyl ingrepp kombineras med denna analys att visualisera subtila defekter i mRNA lokalisering vägen (Messitt et al., 2008). Denna teknik har visat sig vara en relativt enkel och robust test för att upptäcka mRNA distribution i vivo och kan integreras lätt i befintliga biokemiska, molekylära och cellbiologiska tekniker för sondering mekanismer för mRNA transport.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.