Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

Summary

Visualisatie van

Abstract

RNA lokalisatie is een geconserveerd mechanisme van oprichting van celpolariteit. VG1 mRNA lokaliseert aan de plantaardige pool van Xenopus laevis oöcyten en handelt om ruimtelijk te beperken genexpressie van VG1 eiwit. Strikte controle van de VG1 distributie op deze manier is vereist voor een goede kiemlaag specificatie in de zich ontwikkelende embryo. RNA sequentie elementen in de 3 'UTR van het mRNA, de VG1 lokalisatie element (VLE) zijn vereist en voldoende zijn om rechtstreeks vervoer. De studie van de erkenning en het transport van VG1 mRNA in vivo, hebben we een beeldvormende techniek die een uitgebreide analyse van de trans-factor gericht transport mechanismen kan via een eenvoudige visuele uitlezing.

Te visualiseren RNA lokalisatie, we synthetiseren fluorescent gelabelde VLE RNA en microinject dit transcript in individuele eicellen. Na een eicel cultuur om het vervoer van de geïnjecteerde RNA toe te staan, eicellen staan ​​vast en uitgedroogd voorafgaand aan de beeldvorming door confocale microscopie. Visualisatie van mRNA lokalisatie patronen biedt een uitlezing voor het toezicht op de volledige route van RNA transport en voor het identificeren van rollen in regie RNA vervoer voor cis-werkende elementen binnen de transcriptie en trans-werkende factoren die binden aan de ELO (Lewis et al.., 2008, Messitt et al.., 2008). We hebben uitgebreid deze techniek door middel van co-localisatie met extra RNA en eiwitten (Gagnon en Mowry, 2009, Messitt et al.., 2008), en in combinatie met verstoring van motorische eiwitten en het cytoskelet (Messitt et al., 2008). Te probe mechanismen ten grondslag liggen mRNA lokalisatie.

Protocol

Deel 1: Transcriptie van fluorescent gelabelde mRNA.

1. Lineariseren plasmide DNA dat het RNA lokalisatie element of andere relevante reeks en resuspendeer bij 1 ug / ul met DEPC behandeld H ₂ O. De DNA-template moet stroomopwaarts promoter sites voor transcriptie door T7, SP6 of T3 RNA polymerase.
2. Voeg de volgende reagentia om een ​​steriele 1,5 ml tube:

   a. 10X Tx buffer (zie M & M)	2 pi
   b. 20X cap / NTP mix (zie M & M)	1 pi
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 pi
   d. UTP, [α-32 P] (1 pCi / ul) (Perkin Elmer)	1 pi
   e. DEPC-H 2 O	11 pl
   f. 0,2 M DTT	1 pi
   g. RNasin (Promega)	1 pi
   h. lineaire template-DNA	1 pi
   i. RNA polymerase (Promega)	1 pi

3. Meng reagentia en centrifuge kort (10 sec. In een microcentrifuge).
4. Incubeer 2-4 uur bij 37 ° C, voor de buis met aluminium folie om te voorkomen dat fotobleken van de fluorofoor.
5. Voeg 1 pi 1 mg / ml RNase-vrij DNase (Promega) om template DNA af te breken.
6. Incubeer 15 minuten bij 37 ° C.
7. Voeg 79 ul 20 mM EDTA (pH 8,0) om de reactie te stoppen.
8. Verwijder 1 pi tot een afzonderlijke buis, aangeduid als "input" en op te slaan.
9. Spin reactie door middel van een 1 ml G50 kolom (zie Materialen & Methoden), waarin ook zonder rechtspersoonlijkheid nucleotiden met uitsluiting van volledige lengte mRNA.
10. Concentreer de RNA door ethanolprecipitatie:
    1. Voeg 250 ul 100% ethanol, 10 ul 7M CH ₃ COONH _4, 1 ui carrier-RNA (tRNA gist, 10 ug / ul) of 1 ui glycogeen (20 mg / ml).
    2. Meng goed en tot stevig vriezen bij -80 ° C> 30 minuten of op droog ijs gedurende 15 minuten.
    3. Spin op maximale snelheid in microcentrifuge gedurende 15 minuten, giet supernatant.
    4. Wassen met 150 ul van 75% ethanol.
    5. Spin 3 minuten op maximale snelheid in microcentrifuge, decanteren supernatant.
    6. Droog de pellet bij 37 ° C gedurende 3 minuten, zodat alle ethanol verdampt is.
11. Resuspendeer in 11 ul DEPC-H ₂ O en verwijderen 1 pi tot een afzonderlijke buis, aangeduid als "opgenomen".
12. Bepaal het percentage oprichting en verdun het RNA van 50 Nm (zie ook Materiaal en methoden voor de berekening).
13. Het RNA bevroren dienen te worden in 5 ul aliquots, voor eenmalig gebruik te bevriezen / dooi cycli te vermijden en kan worden opgeslagen voor enkele weken bij -80 ° C.

Deel 2: Voorbereiding op micro-injectie.

1. RNA Bereiding:
   Dooi een hoeveelheid van RNA (50 nM), en denaturatie van de RNA bij 70 ° C gedurende 3-5 minuten. Spin gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur microcentrifugepuls op maximale snelheid op een deeltjes te verwijderen, en op het ijs te houden.
2. Eicel Bereiding:
   1. Operatief verwijderen van de eierstokken Xenopus laevis vrouwen (Nasco).
   2. Trim stukken van Xenopus laevis eierstok in een 50 ml conische buis met 25 ml van Collagenase-oplossing (zie ook Materiaal en methoden).
   3. Schud voorzichtig bij 18 ° C gedurende 15 minuten, of tot de eicellen zijn zichtbaar gescheiden van de eierstok. Als gevolg van batch tot batch variatie, kan de behandeling collagenase tijd variëren en moeten zorgvuldig worden gecontroleerd door middel van visuele inspectie om defoliculation te verzekeren.
   4. Laat eicellen om zich te vestigen in de tube, verwijder oplossing weg en was de eicellen met MBSH buffer (zie ook Materiaal en methoden).
   5. Herhaal dit nog twee keer te wassen voor een totaal van drie wasbeurten. Deze eicel isolatie protocol is vergelijkbaar met die beschreven in Cohen et al.., 2009.
   6. Handmatig sorteren stadium III / IV eicellen (Dumont, 1972) in MBSH buffer onder een standaard dissectiemicroscoop. Fase III eicellen zijn volledig ondoorzichtig, maar wit, terwijl stadium IV eicellen zijn iets groter en bezaaid met pigment. Eicellen die iets transparant zijn te jong en eicellen die volledig gepigmenteerde of vertonen gepolariseerd pigment verdeling zijn te oud.
3. Naald Bereiding:
   Trekken en schuine naalden tot een buitendiameter van ~ 0,05 mm. (We maken gebruik van Drummond Wetenschappelijk 3,5 inch haarvaten (order # 3-000-203-G / X), een Sutter Instrument Co micropipet trekker en een WPI Inc beveller.)

Deel 3: micro-injectie

1. Kalibreren naald met DEPC-H ₂ O tot en met 2 nl leveren per injectie. We front load onze naald met behulp van een gas aangedreven microinjector (zie ook Materiaal en methoden), en kalibreren druppelgrootte met behulp van een micrometer.
2. Laad RNA in de naald.
3. Plaats gesorteerd eicellen in een injectie schotel met MBSH buffer. We microinject op een schotel met een laagje zwarte schuimrubber. De bleke eicellen zich goed uit op een witte background.
4. Zorgvuldig te injecteren elke eicel met 2 nl van RNA op 50 nM.
5. Verdrijf RNA, spoel naald met DEPC-H ₂ O, en de belasting volgende RNA voor injectie.

Deel 4: Oocyte Cultuur

1. Plaats eicellen in een putje van een steriele 24 wells plaat (Sigma Aldrich). We cultuur tot een duizend eicellen per well.
2. Verwijder de buffer en te vervangen door 400 ul O ocyte C ULTUUR M edium (OCM, zie Materialen & Methoden) per well. Plaats cultuur plaat in een luchtdichte plastic container met natte papieren handdoek te vochtig milieu te handhaven tijdens de cultuur.
3. Incubeer eicellen bij 18 ° C voor de tijd punten, variërend tussen de 8 en 48 uur.

Deel 5: Fixatie, uitdroging en opslag van Eicellen

1. Sorteren elke dode eicellen en plaats overleven eicellen in glazen flesjes. We zien regelmatig> 90% overleving.
2. Plaats eicellen in MEMFA fixatief (zie Materiaal en methoden) en rock gedurende 20 minuten. Bescherm de eicellen van het licht door afdekken met aluminiumfolie.
3. Was eicellen door het verwijderen van fixatief en te vervangen met een gelijk volume MBSH buffer. Herhaal dit was eens te meer voor een totaal van twee wasbeurten.
4. Was de eicellen in watervrij methanol:
   1. Verwijder de helft van het volume, te vervangen door methanol.
   2. Herhaal stap "a" twee keer.
   3. Verwijder alle van de oplossing, te vervangen door methanol.
   4. Herhalen methanol wassen.
5. Eicellen kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot klaar om de afbeelding.

Deel 6: Imaging RNA Localization door confocale microscopie

1. Voor de beeldvorming, toe te voegen Murray s Clearing Medium (2:1 benzylbenzoaat-benzyl alcohol) om een ​​glazen bodem FluoroDish (WPI Inc) om de beeldvorming bedekken.
2. Breng voorzichtig de eicellen van methanol tot FluoroDish, het minimaliseren van de hoeveelheid methanol overgedragen.
3. Beeld op een omgekeerde confocale microscoop (We hebben met succes gebruik gemaakt van een Zeiss LSM510 en een Leica TCS SP2).

Figuur 1:.. Visualisatie van subcellulaire lokalisatie RNA door micro-injectie van fluorescent gelabelde Afschriften A. Naar aanleiding van micro-injectie, RNA voorzien van Alexa Fluor 546 is in eerste instantie beperkt tot de kern B. Na acht uur van de cultuur, kan een fluorescent gelabelde controle RNA-uniform te zien verspreid in het cytoplasma van de eicel. C. Echter, fluorescent gelabelde RNA bevatten sequenties die werven het transport machines kan worden gezien in het proces van subcellulaire lokalisatie van de plantaardige pool van de eicel (richting beneden). Schaalbalk = 50 pm.

Discussion

Hier hebben we voorgesteld een protocol voor het visualiseren van mRNA lokalisatie in Xenopus oöcyten. Deze methode, met behulp van fluorescent gelabelde RNA-transcripten heeft een hogere signaal-ruisverhouding dan voorheen verkregen met digoxigenine-gelabeld transcripties en is eenvoudiger en sneller dan in-situ gebaseerde benaderingen (Mowry en Melton, 1992, Gautreau et al.., 1997). Met deze methode kunnen we engineer RNA-sequentie mutaties en snel te testen voor in vivo-functie. Verder, door gebruik te maken extra Alexa-UTP fluoroforen, kunnen meerdere RNA soorten gevisualiseerd worden in dezelfde eicel. We hebben gevonden dat in Xenopus oöcyten Alexa Fluor 546-14-UTP superieure resultaten geeft in vergelijking met Alexa Fluor 488-5-UTP als gevolg van autofluorescentie in de 488 nm golflengte, maar dubbele beeldvorming van twee RNA's is toch mogelijk (Gagnon en Mowry, 2009). Ook deze techniek werkt goed in combinatie met immunokleuring protocollen van eiwit colocalization detecteren, zoals een brede waaier van compatibele fluorescente secundaire antilichamen zijn beschikbaar (Yoon en Mowry, 2006, Messitt et al.., 2008). Tot slot kan verstoring van de RNA-lokalisatie proces over-expressie van dominant negatieve factoren of kleine moleculen interferentie gecombineerd worden met deze test aan subtiele defecten in het mRNA lokalisatie pad (Messitt et al., 2008). Visualiseren. Deze techniek heeft zich bewezen als een relatief eenvoudige en robuuste test voor het opsporen van mRNA distributie in vivo worden en kan gemakkelijk worden geïntegreerd in bestaande biochemische, moleculaire en celbiologische technieken voor het sonderen van de mechanismen van mRNA transport.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.