Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Summary

Görselleştirme

Abstract

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 'UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler.

RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Protocol

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon.

1. Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi _H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir.
2. 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin:

   a. 10X Tx tampon (M & M)	2 ul
   b. 20X kapak / NTP mix (M & M)	1 ul
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 ul
   d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / ml) (Perkin Elmer)	1 ul
   e. DEPC-H 2 O	11 ul
   f. 0.2 M DTT	1 ul
   g. RNasin (Promega)	1 ul
   h. doğrusal DNA	1 ul
   i. RNA Polimeraz (Promega)	1 ul

3. Reaktifler hafifçe karıştırın ve kısaca santrifüj (10 sn. Mikrosantrifüj).
4. Tüp fluorofor, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile kaplama, 37 ° C'de 2-4 saat inkübe.
5. DNA aşağılamak için 1 ul 1 mg / ml RNaz ücretsiz DNaz (Promega) ekleyin.
6. 37 az 15 dakika inkübe ° C
7. Reaksiyonu durdurmak için 79 ul 20 mM EDTA (pH 8.0) ekleyin.
8. "Giriş" ve kaydetmek olarak etiketlenmiş ayrı bir tüp, 1 ul çıkarın.
9. 1 ml G50 sütun üzerinden tam uzunlukta mRNA hariç adi nükleotid içerecektir Spin reaksiyonu (Gereç ve Yöntem).
10. RNA etanol yağış Konsantre:
    1. 250 ul% 100 etanol, 10 ul 7M CH ₃ COONH _4, 1 ul taşıyıcı RNA (maya tRNA, 10 mcg / ml) veya 1 ul glikojen (20 mg / ml) ekleyin.
    2. İyice karıştırın ve katı kadar donma -80 ° C> 30 dakika veya 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde.
    3. 15 dakika, süzün süpernatant mikrosantrifüj maksimum hızda dönerler.
    4. 150 ul% 75 etanol ile yıkayın.
    5. Mikrosantrifüj, süzün süpernatant maksimum hızda 3 dakika Spin.
    6. Tüm etanol buharlaştı sağlamak, 3 dakika boyunca 37 ° ° C pelet kurulayın.
11. 11 ul DEPC-H ₂ O süspanse edin ve "anonim" olarak etiketli ayrı bir tüp, 1 ul kaldırmak.
12. Yüzde dahil belirleyin ve 50 nm RNA sulandırmak (Malzeme ve Hesaplama Yöntemleri bakınız).
13. Donma / çözülme döngüleri önlemek için tek kullanımlık, RNA 5 ul alikotları dondurulmuş ve -80 ° C'de birkaç hafta saklanabilir.

Bölüm 2: Mikroenjeksiyon için hazırlanıyor.

1. RNA Hazırlanışı:
   RNA (50 nM) bir kısım çözülme ve RNA denatüre 70 ° C, 3-5 dakika. Herhangi bir parçacık kaldırmak ve buz üzerinde tutmak için, oda sıcaklığında mikrosantrifüj maksimum hız 10 dakika boyunca dönerler.
2. Oosit Hazırlanışı:
   1. Cerrahi Xenopus laevis kadın (Nasco) yumurtalık çıkarın.
   2. 25 ml kollajenaz çözüm içeren 50 ml konik bir tüp içine Xenopus laevis yumurtalık Trim parçaları (Gereç ve Yöntem) .
   3. 18 ° C'de 15 dakika süreyle hafifçe sallayın ya da oosit kadar gözle görülür bir şekilde yumurtalıktan ayrılır. Parti değişimi için toplu iş nedeniyle, kollajenaz tedavi süresi değişebilir ve defoliculation sağlamak için görsel olarak dikkatle izlenmelidir.
   4. Oosit tüp yerleşmek için izin verin, çözüm kaldırmak ve (Gereç ve Yöntem) MBSH tamponu ile oosit yıkayın.
   5. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın. Bu oosit izolasyon protokolü Cohen ve ark, 2009 yılında bu detaylı benzer.
   6. MBSH tampon standart bir diseksiyon mikroskobu altında elle tür evre III / IV oosit (Dumont, 1972). Evre IV oosit pigment ile biraz daha büyük ve benekli ise Evre III oosit, tamamen opak ancak beyaz. Biraz şeffaf Oosit tam pigmentli veya sergi polarize pigment dağılımı çok eski olduğunu, çok genç ve oosit.
3. İğne Hazırlanışı:
   ~ 0.05 mm dış çapı iğne çekin ve konik. (Drummond Bilimsel 3.5 inç kılcal damarlar (sipariş # 3-000-203-G / X), bir Sutter Instrument Co mikropipet çektirmesi ve TEFE Inc beveller.)

Bölüm 3: Mikroenjeksiyon

1. DEPC-H ₂ O ile iğne enjeksiyon başına 2 nl sunmak için kalibre edin. Biz önden bir gaz tahrik mikroenjektör (Gereç ve Yöntem) kullanarak bizim iğne yükü, ve bir mikrometre kullanarak damla boyutu kalibre.
2. RNA iğne içine yükleyin.
3. Oosit sıralaması MBSH tampon içeren bir enjeksiyon çanak içine yerleştirin. Biz siyah köpük kauçuk tabakası ile bir çanak microinject. Soluk oosit beyaz bir backgrou iyi öne çıkıyornd.
4. 50 nM RNA 2 nl ile her oosit dikkatlice enjekte edilir.
5. RNA DEPC-H ₂ O ile durulama, iğne ve enjeksiyon için bir sonraki RNA yüklemek boşaltınız .

Bölüm 4: Oosit Kültür

1. Oosit iyi steril bir 24 plaka (Sigma Aldrich) yerleştirin. Biz de başına bin oosit kültürü.
2. Tamponu çıkarın ve 400 ul O ocyte C ulture M edium ile değiştirin (OCM, Gereç ve Yöntem) ortalama. Kültür plakasına sırasında nemli bir ortam kültürü korumak için ıslak kağıt havlu ile hava geçirmez bir plastik kap içine yerleştirin.
3. 18 ° C, 8 ve 48 saat arasında değişen zaman noktaları için oosit inkübe edin.

Bölüm 5: Oosit Fixation, Dehidrasyon ve Depolama

1. Ölü oosit Sıralama ve cam şişe hayatta oosit. Biz rutin olarak>% 90 hayatta kalma gözlemlemek.
2. MEMFA fiksatif (Gereç ve Yöntem) ve 20 dakika boyunca kaya yerleştirin oosit. Oosit, alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
3. Fiksatif çıkarılması ve MBSH tampon eşit hacmi değiştirilmesi oosit yıkayın. Toplam iki yıkar bir yıkama için bir kez daha tekrarlayın.
4. Susuz metanol içine oosit Yıkama:
   1. Hacminin yarısını çıkarın, metanol ile değiştirin.
   2. "" Iki kez adım tekrarlayın.
   3. Çözüm çıkarın, metanol ile değiştirin.
   4. Metanol yıkama tekrarlayın.
5. Oosit resme hazır kadar -20 ° C'de saklanabilir.

Bölüm 6: Konfokal Mikroskopi Görüntüleme RNA Yerelleştirme

1. Görüntüleme önce, görüntüleme yüzeyini kaplayan cam bir alt FluoroDish (TEFE A.Ş.) Murray Takas Orta (02:01 benzil benzoat-benzil alkol) ekleyin.
2. Dikkatle transfer metanol hacmi en aza indirerek, metanol FluoroDish oosit transfer.
3. Ters bir konfokal mikroskop Görüntü (Biz başarıyla Zeiss LSM510 ve Leica TCS SP2).

Şekil 1: floresan Etiketli Transkriptler Mikroenjeksiyon Subselüler RNA Yerelleştirme Görselleştirme Alexa Fluor 546 etiketli A. takiben mikroenjeksiyon, RNA ilk çekirdeğini sınırlıdır B. kültür sekiz saat sonra, bir floresan etiketli kontrolü RNA eşit şekilde görüleceği oosit sitoplazmasında dağıtılan C. Ancak, taşıma makine işe dizileri içeren floresan etiketli RNA oosit (dibe doğru) bitkisel direğe hücre içi lokalizasyonu sürecinde olabilir. Ölçek çubuğu = 50 mm.

Discussion

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, birden fazla RNA türlerinin aynı oosit görüntülendi olabilir. Alexa Fluor 488-5-488 nm dalga boyu aralığında otofloresans, çünkü UTP ile karşılaştırıldığında Xenopus oositleri Alexa Fluor 546-14-UTP üstün sonuçlar verir bulduk, ancak iki RNA'lar çift görüntüleme (Gagnon ve yine mümkün . Mowry, 2009). Ayrıca, bu tekniğin, protein ko tespit immün protokolleri ile birlikte iyi çalışır floresan uyumlu ikincil antikorlar geniş bir yelpazede (Yoon ve Mowry, 2006, Messitt ve ark, 2008) mevcuttur. Son olarak, RNA yerelleştirme süreci kesintiye uğraması baskın olumsuz faktörler veya küçük molekül girişim ifade aracılığıyla mRNA yerelleştirme yolu ince kusurları (Messitt ve ark, 2008) görselleştirmek için bu testi ile kombine edilebilir. Bu teknik, in vivo olarak mRNA dağıtım tespit etmek için nispeten basit ve sağlam bir test olduğu kanıtlanmıştır ve mRNA taşıma mekanizmaları problama mevcut, biyokimyasal, moleküler ve hücre biyolojik teknikleri kolayca entegre edilebilir.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.