Resonansspektroskopi av levande Drosophila melanogaster Med hjälp av Magic Angle Spinning
Summary
Denna teknik möjliggör användandet av högupplösta magiska vinkel spinning proton MR spektroskopi (HRMAS 1H-MRS) för molekylär karakterisering av levande<em> Drosophila melanogaster</em> Med en konventionell 14,1 Tesla spektrometer utrustad med en HRMAS sond.
Abstract
Högupplösta Magic-Angle Spinning (HRMAS) protoner magnetisk resonans spektroskopi (<sup> 1</sup> H-MRS) är en ny icke-förstörande teknik som förbättrar spektrallinje-bredder och ger högupplösta spektra som kan fås från extrakt, intakta celler, cellodlingar, och ännu viktigare intakt vävnad för att undersöka relationer mellan metaboliter och cellulära processer.<em> In vivo</em> HRMAS<sup> 1</sup> H-MRS studier har ännu inte rapporterats i levande bananfluga<em> Drosophila melanogaster.</em><em> Drosophila,</em> Som en enklare genetisk organism, kan de många biologiska funktioner och olika evolutionärt bevarat signalvägar som skall undersökas på hela organismen nivå och det är en användbar modell för att undersöka genetik och fysiologi. För detta ändamål har vi utvecklat och genomfört en<em> In vivo</em> HRMAS<sup> 1</sup> H-MRS-metoden för att undersöka leva<em> Drosophila</em> På 14,1 T. Vi presenterar här ett HRMAS<sup> 1</sup> H-MRS protokoll för molekylär karakterisering av<em> Drosophila</em> Med en konventionell MR spektrometer utrustad med en HRMAS sond. Denna teknik är en roman,<em> In vivo,</em> Oförstörande<em> Drosophila</em> Metabolit mätmetod, som möjliggör identifiering av sjukdomen biomarkörer och därmed kan bidra till nya terapeutiska utvecklingen.
Protocol
Discussion
Med undantag av den senaste rapporten från möjligheten att in vivo MRT i bananflugor 6 har in vivo MRS studier i bananfluga ännu inte rapporterats. I det nuvarande protokollet beskriver vi genomförandet av en ny in vivo HRMAS 1 H-MRS metod för att upptäcka biologiskt viktiga molekyler. Vi upptäckte framförallt lipider och små metaboliter i levande Drosophila flyger på 14,1 T i ca 45 min, vilket ger tillräcklig förvärvet tid, och samtidigt up…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av en National Institutes of Health (NIH) bevilja AI063433 till Laurence G. Rahme, en National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) till Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, chef för NMR kärna), och en Shriner sjukhus för barn forskningsanslag (# 8893) till A. Aria Tzika. Vi tackar Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. för att få hjälp i de inledande faserna för att utveckla detta protokoll och Ovidiu C. Andronesi Ph.D. för hjälp med TOBSY pulssekvens.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific Corporation | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Bio-Spin | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Bio-Spin | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Bio-Spin | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectra
analysis
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
