Summary
Constrição aórtica transversal (TAC) no rato é um modelo experimental comumente usado para estudar os mecanismos subjacentes a hipertrofia cardíaca eo desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Aqui, descrevemos os procedimentos a constrição da aorta para criar um grau reprodutível de hipertrofia cardíaca em camundongos.
Abstract
Constrição aórtica transversal (TAC) no rato é um modelo experimental comumente usado para a pressão de sobrecarga induzida hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca.
Protocol
Parte 1: Preparação do campo operatório
- O campo de operação é desinfetada com 75% de álcool isopropílico.
- Certifique-se a almofada de aquecimento está ligado e na temperatura certa. Um sistema recomendado é uma bomba de água Gaymar circulando ligada a um bloco de terapia que é mantida a 37 ° C ± 1 ° C. É importante para manter a temperatura corporal normal durante a cirurgia, para evitar uma rápida diminuição da freqüência cardíaca.
- Instrumentos cirúrgicos são esterilizados em estufa quente talão antes da cirurgia. Para este procedimento, você vai precisar dos seguintes instrumentos cirúrgicos: uma tesoura sem corte, é claro curvas forceps X 2, multa de 45 ° pinças anguladas X 2, tesoura primavera angulado, afastador peito, e porta-agulha.
- Aplicadores de algodão deve estar na mão em caso de hemorragia.
Parte 2: Preparação e intubação de Ratos
- Os ratos são anestesiados em uma câmara de indução com isoflurano a 2% misturado com 0,5 -1,0 L / min 100% O 2.
- Cortar cabelo são usados para raspar a pele do decote no peito ao nível médio.
- O mouse é colocado em posição supina sobre uma almofada de aquecimento, a fim de manter a temperatura corporal.
- A faixa de borracha é colocada sobre dentes do animal s da frente para estender o pescoço. Utilizando uma pinça curva em uma das mãos, a língua é delicadamente manipulado para o lado. Com a outra mão, a intubação traqueal é realizada utilizando tubos PE 90. O tubo endotraqueal é então ligado a um ventilador Harvard ciclismo volumétricos de roedores em 125-150 respirações / minuto e um volume corrente de 0,1-0,3 ml. Durante o procedimento cirúrgico, a anestesia é mantida em 1,5-2% com isoflurano 0,5-1,0 L / min 100% O 2. Nível correto de anestesia é verificada através da aplicação de pressão sobre o leito ungueal do mouse (tep pinch-reflex).
- O campo cirúrgico é desinfetada com uma solução de betadine seguido pelo álcool 70%. Este procedimento é repetido três vezes.
- Para evitar a contaminação do campo cirúrgico durante a operação, uma cortina estéril é colocado sobre o mouse, deixando apenas o campo de operação exposta.
- Um conjunto de luvas estéreis é utilizada para cada rato individual.
Parte 3: A ligadura da aorta transversa
- Toracotomia parcial para a segunda costela é realizada sob um microscópio cirúrgico eo esterno retraído com afastador peito.
- Ponta fina 45 ° pinças anguladas são usados para separar delicadamente o tecido do timo e gordura do arco aórtico.
- Após a identificação da aorta transversa, um pequeno pedaço de um fio de seda 6.0 é colocado entre as artérias inominada e carótida esquerda (Figura 1).
- Dois nós soltas são amarradas ao redor da aorta transversa e um pequeno pedaço de uma agulha de 27 ½ blunt indicador é colocado paralelamente à aorta transversa. O primeiro nó é rapidamente amarrado contra a agulha, seguido pelo segundo e da agulha prontamente removidos a fim de produzir uma constrição de 0,4 milímetros de diâmetro. Em camundongos do grupo controle, todo o procedimento é idêntico, exceto para a ligadura da aorta.
- O afastador de tórax é removido e os de saída do ventilador pinched off por 2 segundos para re-inflar os pulmões.
- A caixa torácica é fechado com uma sutura prolene 6.0 com um padrão de sutura interrompido.
- A pele é fechada com uma sutura prolene 6.0 com um padrão de sutura contínua.
Parte 4: recuperação pós-operatória
- Para analgesia pós-operatória, o mouse é injetado com buprenorfina (0,1 mg / kg) por via intraperitoneal. Se houver sinais de desidratação após a cirurgia, solução salina estéril é dada por via intraperitoneal.
- A anestesia é gradualmente reduzido para a posição off e do tubo endotraqueal removido quando os sinais de respiração espontânea ocorrer.
- O mouse é movido para a posição prona e permitiu recuperar em uma almofada de aquecimento.
Parte 5: Confirmação de ligadura de sucesso da aorta transversa
- Uma semana após a TAC, o mouse é re-anestesiados para determinar o grau de sobrecarga de pressão induzida por ligadura da aorta transversa. Como descrito acima, a anestesia é mantida em 1,5-2% com isoflurano 0,5-1,0 L / min 100% O 2 e temperatura corporal mantida a 37 ° C ± 1 ° C.
- A 20 MHz Doppler sonda é colocada sobre os lados esquerdo e direito do pescoço em um ângulo de 45 ° para detectar velocidades de fluxo. Um computador baseado em processador de sinal Doppler (Indus Instruments, Houston, TX) foi utilizado para exibir e armazenar sinais de Doppler 5.
- Dependendo do grau de sobrecarga de pressão necessária para o protocolo experimental, os ratos apenas com um carótida direita (RC) / carótida esquerda (LC) relação de fluxo em um determinado intervalo estão incluídos para análise posterior. Por exemplo, um grau moderado de sobrecarga de pressão leva a uma proporção de 5-8, enquanto que um apertado constrição resultando em sobrecarga de pressão leva grave toa proporção de 8-10 (Figura 5.3A). Um animal sham (operado, mas não ligada), no entanto, espera-se ter uma proporção de aproximadamente 1 (Figura 5.3b).
6: Resultados Representante
A sobrevivência típica de intervenção cirúrgica após TAC em camundongos selvagens é de cerca de 80-90%. Ligadura cirúrgica bem sucedida da aorta transversa levará a uma relação de velocidade de fluxo Doppler entre direita e esquerda da artéria carótida (RC / LC) de 5-10 (Figura 1). Comparado com o sham-operado camundongos (Figura 2A), ratos com sobrecarga de pressão devem desenvolver hipertrofia cardíaca dentro de 1-2 semanas, e dilatação cardíaca após 6-8 semanas, dependendo da tensão da constrição (Figura 2B). Mortalidade durante o primeiro mês após o TAC é tipicamente baixa (<20%) em camundongos selvagens, apesar de camundongos geneticamente modificados podem apresentar diferentes taxas de sobrevivência 6,7.
Figura 1. Confirmação da Ligadura aorta transversa com Doppler medição de velocidade. Representante sinais de velocidade Doppler do direito (RC) e carótida esquerda (LC) artérias seis dias pós-TAC. Essas gravações demonstram uma ligadura de sucesso com uma taxa de fluxo de RC / LC de ~ 6.8. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2. Representante Whole Imagens Coração Após TAC. A B. Sham operados coração de rato tipo selvagem.. Coração de rato tipo selvagem 16 semanas pós-TAC. Cada linha = 1 milímetro.
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Discussion
TAC, que imita estenose aórtica humana, é um método comum para induzir hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca em camundongos. Locais alternativos para a constrição da aorta incluem a aorta ascendente e abdominal. Ascendente constrição aórtica fornece uma sobrecarga extrema e mais rápida sobre o ventrículo esquerdo (LV). Em contraste, a constrição da aorta abdominal deixa intacta uma porção maior da circulação como meio de compensação possível. 8 Portanto, TAC é muitas vezes o modelo preferido em que prevê a sobrecarga LV adequada de forma dependente do tempo, mais passível de investigação. Embora este procedimento pode ser tecnicamente desafiadora, com a prática, temos conseguido uma taxa de sobrevivência de 80-90% em camundongos de tipo selvagem.
O aperto de constrição da aorta transversa determina o grau de desenvolvimento da hipertrofia e do período em que a insuficiência cardíaca e dilatação desenvolve. Além disso, a idade dos ratos afeta a taxa de recuperação e cinética de desenvolvimento da insuficiência cardíaca. Ratos mais velhos (> 12 meses de idade) levam mais tempo para desenvolver uma resposta adaptativa das artérias carótidas a TAC, e são propensos a desenvolver cardiomiopatia dilatada mais rápido do que os ratos mais jovens (3-4 meses de idade) 5.
Não-invasivo intubação de ratos requer alguma prática. Um método alternativo é o seguinte:
- Uma pequena incisão mediana cervical é feito com uma tesoura sem corte e tecidos separados ao redor da traquéia usando uma pinça curva, a fim de expor a traquéia.
- Um pedaço de sutura é colocada ao redor dos dentes da frente e gentilmente afastou-se do corpo do animal para estender o pescoço.
- Utilizando uma pinça curva em uma das mãos, a língua é delicadamente manipulado para o lado.
- Com a outra mão, a intubação traqueal é realizada utilizando tubos PE 90 chanfrado na borda para facilitar a entrada.
O tubo endotraqueal é então ligado a um ventilador Harvard ciclismo volumétricos de roedores em 125-150 respirações / minuto e um volume corrente de 0,1-0,3 ml.
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Acknowledgments
XHTW é um WM Keck Foundation Scholar Distinguished Jovens em Pesquisa Médica, e também é suportado pelo NIH / NHLBI concede R01-R01-HL089598 e R01HL091947 e Muscular Dystrophy Association conceder # 69238. RJvO é o destinatário da Fellowship 2008-2010 American Physiological Society Pós-Doutorado em Physiological Genomics. Este trabalho também é suportado, em parte, pela Aliança para a Fondation Leducq CaMKII Sinalização no Coração.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
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