Summary
Constricción de la aorta transversal (TAC) en el ratón es un modelo de uso experimental para estudiar mecanismos que subyacen a la hipertrofia cardíaca y el desarrollo de insuficiencia cardíaca. Aquí se describen los procedimientos para contraer la aorta para crear un grado de reproducibilidad de la hipertrofia cardiaca en ratones.
Abstract
Constricción de la aorta transversal (TAC) en el ratón es un modelo experimental de uso común para la presión inducida por sobrecarga de la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardiaca.
Protocol
Parte 1: Preparación del campo operatorio
- El campo de operación se desinfecta con un 75% de alcohol isopropílico.
- Asegúrese de que el cojín de la calefacción está encendida y en la temperatura correcta. Un sistema recomendado es un Gaymar bomba de circulación de agua conectados a una plataforma de terapia que se mantiene a 37 ° C ± 1 ° C. Es importante mantener la temperatura corporal normal durante la cirugía para evitar una rápida disminución de la frecuencia cardíaca.
- Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en un esterilizador de calor de cuentas antes de la cirugía. Para este procedimiento, tendrá los siguientes instrumentos quirúrgicos: tijeras de punta roma, por supuesto curva X 2 pinzas, pinzas finas en ángulo de 45 ° X 2, tijeras en ángulo de primavera, retractor en el pecho, y soporte de la aguja.
- Aplicadores de algodón se debe a la mano en caso de hemorragia.
Parte 2: Preparación y la intubación de los ratones
- Los ratones son anestesiados en una cámara de inducción con isoflurano 2% mezclado con 0.5 -1.0 L / min 100% de O 2.
- Cortar el pelo se utilizan para afeitar la piel del escote a la altura del pecho medio.
- El ratón es colocado en posición supina sobre un cojín de la calefacción con el fin de mantener la temperatura corporal.
- Una banda de goma se coloca sobre los dientes delanteros del animal s para extender el cuello. El uso de pinzas curvas en una mano, la lengua es manipulado suavemente a un lado. Con la otra mano, la intubación endotraqueal se realiza con tubería de PE 90. El tubo endotraqueal se conecta a un volumen de Harvard de ciclo en ciclo del ventilador roedores 125-150 respiraciones / minuto y un volumen corriente de 0.1-0.3 ml. Durante la intervención quirúrgica, la anestesia se mantiene en 1,5 a 2% de isoflurano con 0,5 a 1,0 L / min 100% de O 2. Nivel correcto de la anestesia se verifica mediante la aplicación de presión sobre el lecho de la uña del ratón (dedo del pie-una pizca de reflejos).
- El campo quirúrgico se desinfecta con una solución de betadine seguido por 70% de alcohol. Este procedimiento se repite tres veces.
- Para evitar la contaminación del campo quirúrgico durante la operación, un campo estéril se coloca sobre el ratón dejando sólo el campo de operaciones al descubierto.
- Un par de guantes estériles se utiliza para cada ratón individual.
Parte 3: La ligadura de la aorta transversa
- Toracotomía parcial de la segunda costilla se realiza bajo un microscopio quirúrgico y el esternón se retractó de usar un separador en el pecho.
- Punta fina pinza en ángulo de 45 ° se utilizan para separar suavemente el tejido del timo y la grasa del arco aórtico.
- Tras la identificación de la aorta transversa, una pequeña pieza de una sutura de seda 6.0 se coloca entre las arterias carótidas innominada y la izquierda (Figura 1).
- Dos nudos sueltos se atan alrededor de la aorta transversa y una pequeña pieza de un 27 ½ aguja roma de calibre se coloca paralelo a la aorta transversa. El primer nudo es atado rápidamente en contra de la aguja, seguida por la segunda y la aguja se eliminan sin demora con el fin de producir una contracción de 0,4 mm de diámetro. En los ratones control con tratamiento simulado, todo el procedimiento es idéntico, excepto para la ligadura de la aorta.
- El retractor se quita el pecho y la salida del ventilador apagado apretado durante 2 segundos para volver a inflar los pulmones.
- La caja torácica se cierra con una sutura de prolene 6.0 con un patrón de sutura interrumpida.
- La piel se cierra con una sutura de prolene 6.0 con un patrón de sutura continua.
Parte 4: recuperación post-operatoria
- Para la analgesia postoperatoria, el ratón se inyecta con buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía intraperitoneal. Si hay signos de deshidratación después de la cirugía, se le da una solución salina estéril por vía intraperitoneal.
- La anestesia es rebajarse gradualmente a la posición de apagado y el tubo endotraqueal eliminado cuando los signos de respiración espontánea se producen.
- El ratón se mueve a la posición prona y les permitió recuperarse de una almohadilla eléctrica.
Parte 5: Confirmación de la ligadura de éxito de la aorta transversa
- Una semana después de TAC, el ratón se re-anestesia para determinar el grado de sobrecarga de presión inducida por la ligadura de la aorta transversa. Como se describió anteriormente, la anestesia se mantiene en 1,5 a 2% de isoflurano con 0,5 a 1,0 L / min 100% de O2 y la temperatura corporal se mantuvo a 37 ° C ± 1 ° C.
- A 20 MHz Doppler sonda se coloca en los lados izquierdo y derecho del cuello en un ángulo de 45 ° para detectar velocidades de flujo. Un ordenador basado en procesador de señales Doppler (Indo Instruments, Houston, TX) se utiliza para mostrar y almacenar señales de Doppler. 5
- Dependiendo del grado de sobrecarga de presión necesario para el protocolo experimental, los ratones sólo con una carótida derecha (RC) / carótida izquierda (LC) la relación de flujo dentro de cierto rango se incluyen para su posterior análisis. Por ejemplo, un moderado grado de sobrecarga de presión lleva a una proporción de 5-8, mientras que una contracción más estrecha que resulta en una sobrecarga de presión severa lleva tOA cociente de 8.10 (Figura 5.3A). Un animal simulado (operado, pero no ligado), sin embargo, se espera que tenga una proporción de ~ 1 (Figura 5.3b).
6: Resultados de Representante
La supervivencia típica quirúrgica después de la TAC en ratones de tipo salvaje es alrededor de 80-90%. La ligadura quirúrgica exitosa de la aorta transversa dará lugar a una relación de velocidad Doppler del flujo entre la arteria carótida derecha y la izquierda (RC / LC) de 10.5 (Figura 1). En comparación con el simulacro que funciona con los ratones (Figura 2A), los ratones con sobrecarga de presión se espera que se desarrolle la hipertrofia cardiaca en 1-2 semanas, y la dilatación cardiaca después de 6-8 semanas, dependiendo de la tensión de la contracción (Figura 2B). La mortalidad durante el primer mes después de la TAC es más baja (<20%) en ratones de tipo salvaje, a pesar de ratones modificados genéticamente pueden presentar diferentes tasas de supervivencia 6,7.
Figura 1. La confirmación de la ligadura de la aorta transversal con Doppler de medición de velocidad. Representante de las señales de velocidad Doppler de la derecha (CD) y la arteria carótida izquierda (LC) 6 días después de la TAC. Estas grabaciones demuestran una ligadura de éxito con un ratio de flujo de RC / LC de ~ 6.8. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.
Figura 2. Imágenes representativas de todo corazón Después de TAC. A, B. Sham-operado del corazón salvaje del ratón tipo.. Corazón salvaje del ratón tipo 16 semanas después de la TAC. Cada línea = 1 mm.
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Discussion
TAC, que imita a la estenosis aórtica humana, es un método común para inducir la hipertrofia e insuficiencia cardiaca en ratones. Sitios alternativos para la constricción de la aorta incluyen la aorta ascendente y abdominal. Constricción de la aorta ascendente proporciona una sobrecarga extrema y más rápido en el ventrículo izquierdo (VI). Por el contrario, la constricción de la aorta abdominal deja intacta una porción más grande de la circulación como medio de compensación posible. 8 Por lo tanto, la TAC es a menudo el modelo preferido, ya que prevé la sobrecarga adecuada LV de una manera dependiente del tiempo más favorable a la investigación. Aunque este procedimiento puede ser técnicamente difícil, con la práctica, hemos conseguido una tasa de supervivencia del 80-90% en los ratones de tipo salvaje.
La estrechez de la constricción de la aorta transversa determina el grado de desarrollo de la hipertrofia y el tiempo en que la insuficiencia cardiaca y la dilatación se desarrolla. Por otra parte, la edad de los ratones afecta a la tasa de recuperación y la cinética de desarrollo de insuficiencia cardíaca. Ratones de más edad (> 12 meses de edad) tardan más en desarrollar una respuesta adaptativa de las arterias carótidas de TAC, y son propensos a desarrollar miocardiopatía dilatada más rápido que ratones más jóvenes (3-4 meses de edad) 5.
No invasiva de la intubación de los ratones tiene un poco de práctica. Un método alternativo es el siguiente:
- Una pequeña incisión en la línea media del cuello uterino se realiza con tijeras de punta roma y los tejidos separados alrededor de la tráquea utilizando pinzas curvas con el fin de exponer la tráquea.
- Un pedazo de sutura se coloca alrededor de los dientes delanteros y tira suavemente hacia fuera del cuerpo del animal para extender el cuello.
- El uso de pinzas curvas en una mano, la lengua es manipulado suavemente a un lado.
- Con la otra mano, la intubación endotraqueal se realiza con tubería de PE 90 en el borde biselado para facilitar la entrada.
El tubo endotraqueal se conecta a un volumen de Harvard de ciclo en ciclo del ventilador roedores 125-150 respiraciones / minuto y un volumen corriente de 0.1-0.3 ml.
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Acknowledgments
XHTW es un WM Keck Foundation Distinguished Scholar jóvenes en la investigación médica, y también es apoyado por el NIH / NHLBI subvenciones R01-R01 y HL089598 R01HL091947, y Asociación de Distrofia Muscular de subvención # 69238. RJvO es el destinatario de la beca 2008-2010 American Physiological Society postdoctoral en genómica fisiológica. Este trabajo también es apoyado en parte por la Fundación Alianza Leducq de CaMKII en el Corazón de señalización.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
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