Summary
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.
Abstract
המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (> 10
Protocol
פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B (mCD40B) מ splenocytes מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד Murine (CD40L) להביע תאים הלה (tmuCD40L הלה), אשר ישמש צלחת מחויב תאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל Murine CD40-B.
א הכנת תאים מזין (tmuCD40L הלה)
הלה tmuCD40L הוא קו חסיד האנושי תא אפיתל, אשר מעולם לא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ.
- הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה.
- הוסף 4 מ"ל של 1x טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ 2 במשך 10-15 דקות על 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות להפסיק עיכול עם טריפסין.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים:
- 2.5 x 10 6 תאים תת
- 0.4 x 10 6 תאים / היטב הקרנה המשמש בתרבות CD40-B Murine תא
- שאר להקפיא (במידת הצורך).
- ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות.
- הסר את supernatant.
- עבור subculturing: resuspend 2.5 x 10 6 תאים בינוניים 10 מ"ל הבחירה 75 ס"מ 2 בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל) ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. פיצול התאים פעמיים בשבוע.
- עבור התרבות CD40-B Murine התא: אתה צריך 2.4 x 10 6 תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים tmuCD40L הלה בינוני סוג בר בצפיפות של 0.2 x 10 6 תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tmuCD40L תאים הלה הם חסיד (לפחות 4 שעות: לבדוק הדבקות באמצעות מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב)
ב Murine CD40-B תרבית תאים
I. הכנת splenocytes לגירוי-CD40 (יום 0):
שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טרי מיד interleukin-4, ו - β-Mercaptoethanol ציקלוספורין למדיום הגידול Murine לפני השימוש.
- לנתח טחול של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) ולשטוף אותו פעמיים 10-20 מ"ל DMEM בתוספת Gentamycin [15μg/mL] על ידי העברת אותה עם טיפ 10 מ"ל פיפטה משפופרת אחת לאחרת. הימנע העברת מזהמים (למשל שיער) של העכבר. בשר טחון הטחול על ידי העברת אותו דרך מסננת תא (100μm) ולשטוף מסננת עם עוד 10 מ"ל של מדיום. ספין למטה splenocytes ב XG 265 7 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend אותם 7ml muCD40-B בינוני התא לימפוציטים נפרד על ידי צנטריפוגה צפיפות Ficoll. לשם כך התאים בשכבה על 5 מ"ל עכבר Pancoll (שחומם מראש בטמפרטורת החדר) בתוך שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 450 למשך 30 דקות ללא הבלם בטמפרטורת החדר.
- צייר את רוב השכבה העליונה, ומשאיר את השכבה הלימפוציטים באין מפריע על הממשק. העברת שכבת הלימפוציטים לצינור 50 מ"ל טרי, לשטוף פעם עם DMEM 30 מ"ל עם Gentamycin [15μg/mL] על ידי ספינינג למטה XG 265 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום mCD40 B-הכביסה. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא. קביעת מספר תאים על ידי ספירת aliquot ההשעיה התא.
- ספין למטה את הכמות הנדרשת של התאים ב XG 265 במשך 7 דקות. עבור צלחת 6-באר 5 x 10 6 תאים / גם יש צורך, ובכך 30 x 10 6 תאים לכל צלחת.
- הסר את supernatant ו resuspend לימפוציטים ב 1.25 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום mCD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 1 U / mL של interleukin-4 כגורם גדילה, 100 מיקרומטר β-Mercaptoethanol ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תולדה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!).
- הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L הלה.
- בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה הלימפוציטים (1.25 x 10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
- דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2. ביום 3 reculture התאים (המשך II.1.).
השנייה. תת של תאים mCD40B (יום 3 ולאחר מכן פעמיים בשבוע):
- קציר mCD40B תא מצרר על ידי pipetting במרץ מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל.
- ספין למטה XG 265 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום mCD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. Resuspend mCD40B תאים בינוניים mCD40 B-תרבות בריכוז של 0.75 x 10 6 תאים / מ"ל.
- הוספת פתרונות טרי Murine interleukin-4 בריכוז של 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol-β מיקרומטר ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין למדיום.
- הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L מוקרן הלה.
- בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה תא mCD40B (0.75 x 10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
- דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- שוב תת התאים כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים Murine B לאחר סך של 14 ימים.
ג בעיות הירי: מה אם CD40-B תאים לא גדלים?
- בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין?
- האם הצלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי מבוגר 24 שעות?
- האם יש זיהום עם mycoplasma?
- האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי עשה את זה יש את הפעילות הביולוגית המתאים?
- האם β-Mercaptoethanol ו ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון?
איור 1a.
איור 1b.
איור 1d.
איור 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים לגבי אבטחה רעילות in vivo לא נתן סימנים לדלקת או לתגובה אוטומטית חסינות הגדרה זו באמצעות האדם תאים transfected הלה. עם זאת, החלופה הטובה ביותר מייצג Murine מסיסים-CD40 ליגנד עם הפעלת ו מתרבים פעילות באותו זמן, אשר למיטב ידיעתנו לא זמינים מסחרית.
פרוטוקול זה עובד גם עבור לימפוציטים מעכברים 129S2/SvPas (haplotype H-2B), אבל לא הוערך עבור זנים עכבר נוסף עד כה. יתר על כן ההבדלים התאמת צפיפות התאים, ריכוז ציטוקינים, משך הטיפול ציקלוספורין, תרבית תאים התקשורת ומנות עשויה גם להוביל CD40 הפעלה יעילה של תאים B Murine עם שיעורי ריבוי דומה. עם זאת, עבודה אינטנסיבית כבר בילה על אופטימיזציה של מערכת ההפעלה למקסם את שיעורי ריבוי וכתוצאה מכך המערכת הנוכחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומית האירופי לשמירה על חיות מעבדה. בהתייחסו לחוק הגרמני רווחת בעלי החיים החיות נשלטו באופן סדיר על ידי הרשויות המתאימות.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לד"ר קלמנס Wendtner למתן tmuCD40-ליגנד, הלה קו התא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).
- Kondo, E. Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells. J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).
- Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of human CD40-activated B cells. J Vis Exp. 32, (2009).
- von Bergwelt-Baildon, M. CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).
- Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides. Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).
- Bergwelt-Baildon, M. S. von Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).
- Mayr, C. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 107 (2), 742-751 (2006).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).
