Summary
In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.
Abstract
Forschung auf B-Zellen haben gezeigt, dass CD40-Aktivierung ihrer Antigen-Präsentation Kapazität verbessert. Wenn mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L) stimuliert, kann das menschliche B-Zellen ohne Schwierigkeiten von kleinen Mengen von peripheren Blut innerhalb von 14 Tagen bis sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (erweiterbar> 10
Protocol
Das Protokoll für die Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen (mCD40B) von Splenozyten ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von Maus-CD40-Ligand (CD40L) exprimierende HeLa-Zellen (tmuCD40L HeLa), die als verwendet werden Platten- Feeder-Zellen gebunden. Teil B beschreibt die eigentliche murine CD40-B Kultur.
A. Herstellung von Feeder-Zellen (tmuCD40L HeLa)
Die tmuCD40L HeLa ist ein Anhänger menschlichen epithelialen Zell-Linie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen.
- Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen.
- 4 mL 1x Trypsin / EDTA in einer 75 cm 2-Kolben für 10-15 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen.
- Fügen Sie 10 ml Wildtyp-Medium-und schwenkbar sanft die Verdauung mit Trypsin zu stoppen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen:
- 2,5 x 10 6 Zellen für Subkultur
- 0,4 x 10 6 Zellen / well für die Bestrahlung von murinen CD40-B-Zell-Kultur verwendet
- Rest einfrieren (falls erforderlich).
- Drehen Sie die Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten.
- Entfernen Sie den Überstand.
- Für Subkultivierung: resuspendieren 2,5 x 10 6 Zellen in 10 ml Selektionsmedium in eine 75 cm 2 Zellkulturflasche (Zelldichte 2,5 x 10 5 Zellen / ml) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Split die Zellen zweimal pro Woche.
- Für die murine CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 2,4 x 10 6 Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren tmuCD40L HeLa-Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,2 x 10 6 Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tmuCD40L HeLa-Zellen adhärent sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung unter dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.)
B. Murine CD40-B-Zell-Kultur
I. Herstellung von Splenozyten für CD40-Stimulation (Tag 0):
Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von murinen Interleukin-4, β-Mercaptoethanol und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch.
- Dissect Milz von C57BL / 6 Mäuse (Haplotyp H-2b) und waschen Sie es zweimal in 10-20 ml DMEM, ergänzt mit Gentamycin [15μg/mL], indem er sie mit einer 10 ml Pipette aus einer Röhre zur anderen. Vermeiden Sie die Übertragung Verunreinigungen (zB Haare) der Maus. Mince Milz, indem es durch eine Zelle Sieb (100 um) und spülen Sieb mit weiteren 10 ml Medium. Spin down Splenozyten bei 265 xg für 7 min bei Raumtemperatur resuspendieren sie in 7 ml muCD40-B-Zell-Medium und separate Lymphozyten durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation. Dazu Schicht Zellen auf 5 mL Mouse-Pancoll (vorgeheizt bei Raumtemperatur) in einer 15 ml-Tube und zentrifugieren bei 450 xg für 30 min ohne Bremse bei Raumtemperatur.
- Beziehen Sie die meisten der oberen Schicht, so dass die Lymphozyten Schicht ungestört an der Schnittstelle. Transfer-Lymphozyten Schicht auf eine frische 50 ml Tube, einmal waschen mit 30 ml DMEM mit Gentamycin [15μg/mL] indem sie zum Stillstand bei 265 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und Zellen in 10 ml mCD40-B Waschmedium. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension. Bestimmen der Zellzahl durch Zählen ein Aliquot der Zellsuspension.
- Spin down die benötigte Menge an Zellen bei 265 xg für 7 Minuten. Für eine 6-well-Platte 5 x 10 6 Zellen / well benötigt werden, damit 30 x 10 6 Zellen pro Platte.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Lymphozyten bei 1,25 x 10 6 Zellen / ml in mCD40-B Kulturmedium frisch mit 1 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor, 100 uM β-Mercaptoethanol und 0,63 ug / ml Cyclosporin A zu verhindern Auswachsen von T-Zellen (Given Konzentrationen beziehen sich auf ein mL Kulturmedium!).
- Entfernen Sie den Überstand aus der 6-well-Platte mit tmuCD40L HeLa-Zellen vorinkubiert.
- Vorsichtig 4 ml der Lymphozyten-Suspension (1,25 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
- Die Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2. Am Tag 3 reculture der Zellen (Fahren Sie mit II.1.).
II. Subkultur der mCD40B Zellen (Tag 3 und dann zweimal in der Woche):
- Ernte mCD40B Zellverband durch kräftiges Auf-und Abpipettieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube.
- Spin down bei 265 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit mCD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 265 xg für 7 Minuten. Resuspendieren mCD40B Zellen in mCD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 0,75 x 10 6 Zellen / ml.
- Fügen Sie frische Lösungen von murinen Interleukin-4 in einer Konzentration von 1 U / mL, 100 uM β-Mercaptoethanol und 0,63 ug / ml Cyclosporin A auf das Medium.
- Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-Well-Platte mit bestrahlten tmuCD40L HeLa-Zellen vorinkubiert.
- Vorsichtig 4 ml des mCD40B Zellsuspension (0,75 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte.
- Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Wieder Subkultur der Zellen alle 3-4 Tage am Ende mit hochreinem murine CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen.
C. Trouble-shooting: Was ist, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen?
- Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen?
- Sind die Platten-gebundenen Feeder-Zellen für die Stimulation älter als 24 Stunden verwendet werden?
- Gibt es eine Kontamination mit Mykoplasmen?
- War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hat es über die entsprechenden biologischen Aktivität?
- War β-Mercaptoethanol und Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration?
Abbildung 1a.
Abbildung 1b.
Abbildung 1d.
Abbildung 2.
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Discussion
Änderungen dieses Protokolls sind möglich, insbesondere über die Herkunft der CD40-Stimulus und die Art der Maus-Stamm verwendet, auch Nachgeben in effiziente Erzeugung von Maus-CD40-aktivierten B-Zellen. Ahmadi et al. haben gezeigt, ähnliche Ergebnisse für Maus-Fibroblasten mit murinen CD40-Ligand transfiziert. In diesem Zusammenhang Präsentation der Xeno-Antigen kann mit Sicherheit ausgeschlossen werden, aber intensive Studien hinsichtlich Sicherheit und Toxizität in vivo gab keine Anzeichen für eine Entzündung oder Auto-Immunreaktion in dieser Einstellung mit menschlichen transfizierten HeLa Zellen. Allerdings stellt die beste Alternative eine lösliche murine CD40-Ligand mit der Aktivierung und Proliferation Aktivität zur gleichen Zeit, die unser Wissen ist nicht im Handel erhältlich.
Dieses Protokoll arbeitet auch für Lymphozyten aus 129S2/SvPas Mäuse (Haplotyp H-2b), hat aber nicht für die weitere Mausstämme bisher ausgewertet. Weiterhin Differenzen in Anpassung der Zelldichte, Zytokin-Konzentration, die Dauer von Cyclosporin A Behandlung kann Zellkulturmedien und Gerichte auch für eine effiziente CD40-Aktivierung von murinen B-Zellen mit ähnlichen Proliferation führen. Allerdings hat die intensive Arbeit an der Optimierung dieses Systems zu maximieren Aktivierung und Proliferation, woraus sich das gegenwärtige System ausgegeben worden.
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Disclosures
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen und europäischen Richtlinien für Labor Tierhaltung durchgeführt. Unter Bezugnahme des deutschen Tierschutzgesetz wurden die Tiere regelmäßig von den zuständigen Behörden kontrolliert.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Clemens Wendtner für die Bereitstellung tmuCD40-Ligand-HeLa-Zelllinie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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