Summary
Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d'activation de CD40-et à l'expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d'antigène (APC) pour étudier l'induction de l'immunité.
Abstract
La recherche sur les cellules B CD40 a montré que l'activation améliore leur capacité de présentation antigénique. Lorsqu'ils sont stimulés par l'interleukine-4 et CD40 ligand (CD40L), les lymphocytes B humains peut être étendu sans difficulté à partir de petites quantités de sang périphérique dans les 14 jours pour très grandes quantités de très-pur-CD40 des cellules B (> 10
Protocol
Le protocole pour la génération de cellules murines B CD40-activé (mCD40B) à partir de splénocytes est divisé en deux parties: la partie A montre la préparation d'murin CD40 ligand (CD40L) exprimant des cellules HeLa (HeLa tmuCD40L), qui sera utilisé comme plate- liés cellules nourricières. Partie B décrit la réelle murin CD40-B de la culture.
A. Préparation de cellules nourricières (tmuCD40L HeLa)
Les cellules HeLa tmuCD40L est une adhérente lignée humaine de cellules épithéliales, qui ne devrait jamais devenir complètement confluentes. Les cellules sont donc découpé deux fois par semaine. La culture sur plus de six semaines n'est pas recommandée.
- Retirer ancien milieu de la culture primaire avec une pipette stérile et laver les cellules avec 10 ml de PBS 1x. Aspirer le PBS après le lavage.
- Ajouter 4 mL de 1x trypsine / EDTA dans un flacon de 75 cm2 pendant 10-15 minutes à 37 ° C. Utilisez tapotant doucement pour détacher les cellules.
- Ajouter 10 ml de milieu de type sauvage et pivotant doucement pour arrêter la digestion à la trypsine.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml avec une pipette stérile et le spin des cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes.
- Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 10 mL de milieu de type sauvage. Comptez le nombre de cellules d'une aliquote de la suspension cellulaire et préparer trois tubes de 50 ml avec le nombre approprié de cellules:
- 2,5 x 10 6 cellules pour une sous-culture
- 0,4 x 10 6 cellules / puits pour l'irradiation utilisée pour la culture de cellules CD40-B murines
- restant à geler (si nécessaire).
- Faites tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes.
- Enlever le surnageant.
- Pour repiquage: resuspendre 2,5 x 10 6 cellules dans 10 ml milieu de sélection dans un flacon de 75 cm2 de culture de cellules (2,5 x densité cellulaire 10 5 cellules / ml) et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Fractionner les cellules deux fois par semaine.
- Pour la culture de cellules CD40-B murines: Vous avez besoin de 2,4 x 10 6 cellules pour une plaque de 6 puits. Resuspendre les cellules HeLa tmuCD40L en milieu sauvage à une densité de 0,2 x 10 6 cellules / ml et les irradier à 78 Gy. Planche 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits et les incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez cette assiettes préparées pour la stimulation des lymphocytes B lors tmuCD40L cellules HeLa sont adhérentes (au moins 4 heures: vérifier l'adhérence à l'aide du microscope, ne pas attendre plus de 24 h pour commencer la stimulation des lymphocytes B). (Continuer avec B.)
B. murin CD40-culture de cellules B
I. Préparation des splénocytes pour CD40-stimulation (jour 0):
S'il vous plaît noter: avant de continuer de s'assurer que les cellules nourricières sont adhérentes. Toujours ajouter de nouvelles solutions d'murin immédiatement interleukine-4, β-mercaptoéthanol et cyclosporine A au milieu de croissance avant l'utilisation.
- Disséquer la rate de souris C57BL / 6 (haplotype H-2b) et il laver deux fois dans 10-20 ml de DMEM complété avec Gentamycine [15μg/mL] en le transférant avec une pointe de pipette 10 ml d'un tube à l'autre. Évitez les contaminants transfert (par exemple les cheveux) de la souris. Hacher la rate en passant à travers une passoire cellulaire (100 microns) et rincez avec un autre filtre de 10 mL de milieu. Isoler splénocytes à 265 xg pendant 7 min à température ambiante, les remettre en suspension dans 7mL muCD40-B milieu cellulaire, et les lymphocytes séparés par centrifugation de densité de Ficoll. Pour ce faire des cellules couche sur 5 ml souris Pancoll (préchauffé à la température ambiante) dans un tube de 15 ml et centrifuger à 450 xg pendant 30 min sans frein à la température ambiante.
- Prélever la plupart de la couche supérieure, laissant intacte la couche de lymphocytes à l'interface. Transfert couche de lymphocytes dans un nouveau tube de 50 ml, laver une fois avec 30 ml de DMEM avec Gentamycine [15μg/mL] en faisant tourner le bas à 265 xg pendant 7 min pour éliminer d'autres cellules. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu B mCD40-linge. Déterminer le nombre de cellules dans une aliquote de la suspension cellulaire. Déterminer le nombre de cellules en comptant une aliquote de la suspension cellulaire.
- Isoler le montant requis de cellules à 265 xg pendant 7 minutes. Pour une plaque à 6 puits 5 x 10 6 cellules / puits sont nécessaires, donc 30 x 10 6 cellules par plaque.
- Retirer le surnageant et remettre les lymphocytes à 1,25 x 10 6 cellules / ml dans mCD40-B milieu de culture fraîchement complété avec 1 U / ml d'interleukine-4 comme facteur de croissance, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A pour prévenir la excroissance de cellules T (concentrations données se référer à un milieu de culture ml!).
- Retirer le surnageant de la plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa tmuCD40L.
- Ajouter délicatement 4 mL de la suspension lymphocytaire (1,25 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
- Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO 2. Au jour 3 reculture les cellules (Continuer avec II.1.).
II. Repiquage de cellules mCD40B (3 jours et ensuite deux fois par semaine):
- Grappe des piles à Moisson mCD40B par vigoureusement aspiration et refoulement avec une pipette de 10 ml et de les mettre dans un tube de 50 ml.
- Isoler à 265 xg pendant 7 minutes et remplacer complètement le surnageant avec mCD40-B milieu de lavage. Alors que le comptage des cellules du montant d'une aliquote, tourner les cellules vers le bas à 265 xg pendant 7 minutes. Resuspendre les cellules dans mCD40B mCD40-B milieu de culture à une concentration de 0,75 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter de nouvelles solutions d'murin de l'interleukine-4 à une concentration de 1 U / ml, 100 M β-mercaptoéthanol et 0,63 g / mL cyclosporine A dans le milieu.
- Retirer le surnageant dans une plaque de 6 puits de pré-incubées avec des cellules HeLa irradiées tmuCD40L.
- Ajouter délicatement 4 mL de la suspension cellulaire mCD40B (0,75 x 10 6 cellules / ml) dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
- Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Encore une fois les cellules sous-culture tous les 3-4 jours pour finir avec très pure murin cellules B CD40-activé après un total de 14 jours.
C. Dépannage: Que faire si le CD40-B cellules ne poussent pas?
- Avez-vous vérifié l'expression du ligand CD40 des cellules nourricières?
- Les cellules de la plaque liée alimentation utilisée pour la stimulation de plus de 24h?
- Yat-il une contamination par des mycoplasmes?
- Était la solution interleukine-4 utilisé pour la supplémentation fraîchement dégelé et at-elle avoir l'activité biologique approprié?
- Etait-β-mercaptoéthanol et la cyclosporine A a ajouté de la concentration correcte?
Figure 1a.
Figure 1b.
Figure 1d.
Figure 2.
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Discussion
Modifications de ce protocole sont possibles, notamment sur l'origine du CD40-stimulus et le type de souche de souris utilisée, également dans la production à rendement efficace de cellules murines B CD40-activé. Ahmadi et al. ont montré des résultats similaires pour les fibroblastes de souris transfectées avec CD40-ligand murin. Dans ce contexte de présentation xéno-antigènes peut être exclu avec certitude, mais des études intensives concernant la sécurité et la toxicité in vivo a donné aucun signe d'inflammation ou de réaction auto-immunité dans ce cadre à l'aide humaine transfectée cellules HeLa. Cependant, la meilleure alternative représente une murin CD40 soluble-ligand avec l'activation et la prolifération d'activité dans le même temps, ce qui est à notre connaissance pas disponible commercialement.
Ce protocole fonctionne également pour les lymphocytes de souris 129S2/SvPas (haplotype H-2b), mais n'a pas été évaluée pour les autres souches de souris jusqu'ici. Par ailleurs des différences dans l'ajustement de la densité cellulaire, la concentration des cytokines, la durée de la cyclosporine A de traitement, des milieux de culture cellulaire et les plats peuvent aussi conduire à CD40-activation efficace des cellules B murines avec des taux de prolifération similaires. Toutefois, un travail intensif a été consacré à l'optimisation de ce système d'activation et de maximiser les taux de prolifération découlant du système actuel.
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Disclosures
Les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives nationales et européennes pour garder des animaux de laboratoire. Se référant à la loi allemande du bien-être des animaux les animaux ont été contrôlés régulièrement par les autorités compétentes.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Clemens gentiment Wendtner pour fournir lignée cellulaire tmuCD40-Ligand-HeLa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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