Summary
इस वीडियो में, हम CD40 सक्रियण और murine C57BL / 6 चूहों के splenocytes है, जो एक मॉडल प्रतिजन पेश सेल (APC) के उन्मुक्ति का प्रेरण का अध्ययन करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है से बी कोशिकाओं के विस्तार की प्रक्रिया प्रदर्शित करता है.
Protocol
murine CD40 सक्रिय splenocytes से बी कोशिकाओं (mCD40B) की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल को दो भागों में बांटा गया है: भाग murine CD40 (CD40L) ligand HeLa कोशिकाओं (tmuCD40L HeLa) व्यक्त की तैयारी के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा थाली को दर्शाता है फीडर कोशिकाओं बाध्य. पार्ट बी वास्तविक murine CD40 बी संस्कृति का वर्णन करता है.
फीडर कोशिकाओं ए तैयार (tmuCD40L HeLa)
tmuCD40L HeLa एक पक्षपाती मानव उपकला कोशिका लाइन, जो पूरी तरह से मिला हुआ कभी नहीं हो जाना चाहिए है. कोशिकाओं इसलिए प्रति सप्ताह दो बार splitted रहे हैं. अधिक से अधिक 6 सप्ताह से अधिक संवर्धन अनुशंसित नहीं है.
- प्राथमिक संस्कृति से एक बाँझ विंदुक के साथ पुराने मध्यम और 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं धोने निकालें. धोने के बाद Aspirate पीबीएस.
- 10-15 मिनट के लिए एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में 37 पर 4 1x trypsin / EDTA एमएल जोड़ें डिग्री सेल्सियस कोमल दोहन का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
- जंगली प्रकार के माध्यम से 10 एमएल जोड़ें और धीरे से कुंडा trypsin साथ पाचन रोक.
- 50 एमएल ट्यूब में एक बाँझ विंदुक के साथ सेल निलंबन और स्थानांतरण कोशिकाओं 7 मिनट के लिए 265 XG पर नीचे स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और जंगली प्रकार के माध्यम से 10 एमएल में सेल गोली resuspend. सेल निलंबन के एक विभाज्य के सेल नंबर की गणना और कक्षों की उचित संख्या के साथ तीन 50 एमएल ट्यूबों तैयार:
- 2.5 x 10 subculture के लिए 6 कोशिकाओं
- 0.4 x 10 / अच्छी तरह से विकिरण के लिए 6 कोशिकाओं murine CD40 बी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया
- शेष को स्थिर (यदि आवश्यक).
- कोशिकाओं 7 मिनट के लिए 265 XG पर नीचे स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- Subculturing के लिए: resuspend 2.5 x 10 6 कोशिकाओं में एक 75 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में 10 एमएल चयन मध्यम (सेल घनत्व 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) और 37 पर कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस के साथ 5% सीओ 2. कोशिकाओं भाजित दो बार प्रति सप्ताह.
- Murine CD40 बी सेल संस्कृति के लिए: आप 2.4 x 10 एक 6-अच्छी तरह से थाली के लिए 6 कोशिकाओं की जरूरत है. जंगली प्रकार के मध्यम में tmuCD40L HELA कोशिकाओं 0.2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व और Resuspend 78 Gy पर उन्हें चमकाना . प्लेट अच्छी तरह से प्रत्येक और उन्हें 37 में सेते ° सी के साथ 5% सीओ 2 में 2 सेल निलंबन की एमएल. बी सेल उत्तेजना के लिए तैयार इस प्लेट का उपयोग जब tmuCD40L HELA कोशिकाओं अनुयायी हैं (कम से कम 4 घंटे: पालन की जांच खुर्दबीन का उपयोग, अधिक से अधिक 24 घंटे प्रतीक्षा करने के लिए नहीं बी सेल उत्तेजना शुरू कर दिया). (बी के साथ जारी रखें)
बी CD40 बी सेल संस्कृति murine
मैं उत्तेजना CD40 (0 दिन) के लिए splenocytes की तैयारी:
कृपया ध्यान दें: इससे पहले कि आप पता लगाना जारी रखने कि फीडर कोशिकाओं पक्षपाती हैं. हमेशा murine उपयोग करने से पहले 4-इंटरल्यूकिन, β-Mercaptoethanol और मध्यम विकास के लिए एक cyclosporin तुरंत ताजा समाधान जोड़ें.
- यह एक ट्यूब से एक 10ml विंदुक एक और टिप के साथ स्थानांतरित द्वारा C57BL / 6 चूहों (एच-2b haplotype) की तिल्ली काटना और यह 10-20 एमएल DMEM में दो बार धोने Gentamycin [15μg/mL] के साथ पूरक. माउस के हस्तांतरण contaminants के (जैसे बाल) से बचें. यह एक सेल झरनी (100μm) के माध्यम से गुजर द्वारा तिल्ली कीमा और माध्यम की एक और 10 एमएल के साथ झरनी कुल्ला. नीचे कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 265 XG पर splenocytes स्पिन, उन्हें muCD40 बी 7mL में सेल, मध्यम, और Ficoll घनत्व centrifugation द्वारा अलग लिम्फोसाइटों resuspend. इसलिए कमरे के तापमान पर ब्रेक के बिना 5 एमएल माउस में एक 15 एमएल और 30 मिनट के लिए 450 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र Pancoll (कमरे के तापमान पर) preheated पर परत की कोशिकाओं करने के लिए.
- ऊपरी परत की सबसे ड्रा, लिम्फोसाइट परत इंटरफेस में undisturbed छोड़ने. एक ताजा 50 एमएल ट्यूब लिम्फोसाइट परत स्थानांतरण, Gentamycin [15μg/mL] के साथ 30ml DMEM के साथ एक बार 7 मिनट के लिए 265 XG पर नीचे कताई के लिए अन्य कोशिकाओं को हटाने से धो. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और mCD40 बी धोने के माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं resuspend. सेल निलंबन के एक विभाज्य में सेल नंबर का निर्धारण करते हैं. सेल निलंबन के एक विभाज्य गिनती सेल नंबर का निर्धारण करते हैं.
- 7 मिनट के लिए 265 XG पर नीचे की कोशिकाओं के लिए आवश्यक राशि स्पिन. एक 6 अच्छी तरह से 5 थाली के लिए x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से की जरूरत है, 30 x 10 प्रति प्लेट 6 कोशिकाओं इस प्रकार है.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1.25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल लिम्फोसाइटों mCD40 बी संस्कृति हौसले 1 यू / इंटरल्यूकिन -4 के एमएल के साथ पूरक मध्यम में वृद्धि कारक के रूप में, 100 सुक्ष्ममापी β-Mercaptoethanol और 0.63 μg / एमएल cyclosporin एक को रोकने के लिए resuspend टी कोशिकाओं के परिणाम (देखते हुए सांद्रता एक एमएल संस्कृति मध्यम देखें!).
- 6 अच्छी तरह से थाली tmuCD40L HELA कोशिकाओं के साथ पूर्व - incubated से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- धीरे लिम्फोसाइट निलंबन के 4 एमएल (1.25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ सकते हैं.
- 37 पर थाली सेते 5% के साथ डिग्री सेल्सियस सीओ 2 . 3 दिन कोशिकाओं (II.1 के साथ जारी रखें.) Reculture.
द्वितीय. MCD40B कोशिकाओं (3 दिन और फिर दो बार एक सप्ताह) के subculture:
- सख्ती ऊपर और नीचे एक 10 एमएल और 50 एमएल ट्यूब में उन्हें पूल विंदुक के साथ pipetting द्वारा हार्वेस्ट mCD40B सेल क्लस्टर.
- 7 मिनट के लिए 265 XG पर नीचे स्पिन और mCD40 बी धोने के माध्यम के साथ पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला जगह. जबकि एक विभाज्य के सेल राशि की गणना, कोशिकाओं नीचे स्पिन 7 मिनट के लिए 265 XG. Resuspend mCD40B कोशिकाओं mCD40 बी संस्कृति माध्यम में 0.75 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में.
- 1 यू / एमएल, 100 सुक्ष्ममापी β-Mercaptoethanol और 0.63 μg / एमएल मध्यम के लिए एक cyclosporin की एकाग्रता में इंटरल्यूकिन 4 murine ताजा समाधान जोड़ें.
- 6 अच्छी तरह से थाली पूर्व विकिरणित tmuCD40L HELA कोशिकाओं के साथ incubated से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- धीरे 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह mCD40B सेल निलंबन (0.75 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) की 4 एमएल जोड़ें.
- 37 में प्लेटें सेते 5% के साथ डिग्री सेल्सियस सीओ 2 .
- फिर कोशिकाओं हर 3-4 दिनों के अत्यधिक शुद्ध murine CD40 सक्रिय कुल 14 दिनों के बाद बी कोशिकाओं के साथ समाप्त करने के लिए subculture.
सी. मुसीबत शूटिंग: क्या होगा यदि CD40 बी कोशिकाओं हो जाना नहीं है?
- क्या तुमने फीडर कोशिकाओं के CD40 ligand अभिव्यक्ति के लिए जाँच?
- थाली बाध्य फीडर 24 घंटों से अधिक पुराने उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं रहे हैं?
- Mycoplasma के साथ संदूषण है?
- इंटरल्यूकिन 4 पूरकता के लिए इस्तेमाल किया समाधान हौसले से thawed और था कि यह उपयुक्त जैविक गतिविधि है?
- Β-Mercaptoethanol और cyclosporin एक सही एकाग्रता में जोड़ा?
चित्रा 1a.
चित्रा 1b.
चित्रा 1d.
चित्रा 2.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के संशोधन संभव हो रहे हैं, विशेष रूप से CD40 उत्तेजना और माउस तनाव का इस्तेमाल किया प्रकार के मूल के बारे में भी murine CD40 सक्रिय बी कोशिकाओं के कुशल पीढ़ी में उपज है. अहमदी एट अल. murine CD40-ligand के साथ ट्रांसफ़ेक्ट माउस fibroblasts के लिए इसी तरह के परिणाम से पता चला है. Xeno प्रतिजन के इस संदर्भ प्रस्तुति में निश्चितता के साथ बाहर रखा जा सकता है, लेकिन सुरक्षा और vivo में विषाक्तता के बारे में गहन अध्ययन इस सेटिंग का उपयोग मानव ट्रांसफ़ेक्ट HELA कोशिकाओं में सूजन या ऑटो उन्मुक्ति प्रतिक्रिया के लिए कोई संकेत नहीं दिया. हालांकि, सबसे अच्छा विकल्प सक्रिय करने और एक ही समय है, जो हमारे ज्ञान करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है पर proliferating गतिविधि के साथ एक घुलनशील CD40 ligand murine का प्रतिनिधित्व करता है.
इस प्रोटोकॉल भी 129S2/SvPas चूहों (एच-2b haplotype) से लिम्फोसाइटों के लिए काम करता है, लेकिन आगे माउस उपभेदों के लिए मूल्यांकन नहीं किया गया अब तक. इसके अलावा सेल घनत्व के समायोजन में अंतर, साइटोकाइन एकाग्रता, cyclosporine की अवधि के उपचार, सेल संस्कृति मीडिया और व्यंजन भी murine बी कोशिकाओं के समान प्रसार दर के साथ कुशल CD40 - सक्रियण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हालांकि, गहन काम इस सक्रियण और प्रसार वर्तमान प्रणाली में जिसके परिणामस्वरूप दरों को अधिकतम प्रणाली के अनुकूलन पर खर्च किया गया है.
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Disclosures
प्रयोगों प्रयोगशाला पशु रखने के लिए राष्ट्रीय और यूरोपीय दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. जर्मन पशु कल्याण कानून का जिक्र करते हुए पशुओं को नियमित रूप से उचित अधिकारियों द्वारा नियंत्रित किया गया.
Acknowledgments
हम अनुरोध tmuCD40 ligand-HeLa सेल लाइन उपलब्ध कराने के लिए डॉ. क्लेमेंस Wendtner धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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