Summary
En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.
Abstract
La investigación sobre células B CD40 ha demostrado que mejora la capacidad de activación de la presentación de antígenos. Cuando se estimula con la interleucina-4 y CD40 ligando (CD40L), las células B se puede ampliar sin problemas a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica dentro de 14 días a cantidades muy grandes de muy pura de células B CD40-(> 10
Protocol
El protocolo para la generación de murino CD40-linfocitos B activados (mCD40B) a partir de esplenocitos se divide en dos partes: la parte A demuestra la preparación de murino CD40 ligando (CD40L) que expresan las células HeLa (tmuCD40L HeLa), que se utiliza como placa- obligados células alimentadoras. La parte B describe la actual murino CD40-B cultura.
A. Preparación de las células de alimentación (tmuCD40L HeLa)
El HeLa tmuCD40L es un adherente línea humana de células epiteliales, lo que nunca debe ser totalmente confluente. Las células son por lo tanto, dividido dos veces por semana. El cultivo de más de más de 6 semanas no es recomendable.
- Quitar medio de edad de la cultura de primaria con una pipeta estéril y lavar las células con 10 ml de PBS 1x. Aspirar el PBS después del lavado.
- Agregar 4 ml de 1x tripsina / EDTA en un matraz de 75 cm 2 durante 10-15 minutos a 37 ° C. Use suaves golpecitos para separar las células.
- Agregar 10 ml de medio de tipo salvaje y giro con suavidad para detener la digestión con tripsina.
- La transferencia de la suspensión de células en un tubo de 50 ml con una pipeta estéril y el giro de las células hacia abajo a 265 xg durante 7 minutos.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 10 ml de medio de tipo salvaje. Cuente el número de células de una parte alícuota de la suspensión celular y preparar tres tubos de 50 ml con el número adecuado de células:
- 2.5 x 10 6 células de la subcultura
- 0,4 x 10 6 células / pocillo de irradiación utilizadas para el cultivo de células murinas CD40-B
- resto de congelar (si es necesario).
- Giro de las células hacia abajo a 265 xg durante 7 minutos.
- Eliminar el sobrenadante.
- Para subcultivo: resuspender 2,5 x 10 6 células en 10 ml de medio de selección de 75 cm 2 frasco de cultivo celular (densidad celular de 2,5 x 10 5 células / ml) e incubar las células a 37 º C con CO2 al 5%. Dividir las células dos veces por semana.
- Para el cultivo de células murinas CD40-B: Es necesario 2,4 x 10 6 células por uno de 6 pocillos. Resuspender las células HeLa tmuCD40L en el medio silvestre, con una densidad de 0,2 x 10 6 células / ml e irradiar a los 78 Gy. Placa de 2 ml de la suspensión celular en cada pocillo y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Utilice esta platos preparados para la estimulación de células B en células HeLa tmuCD40L son adherentes (por lo menos 4 horas: comprobar el cumplimiento con el microscopio, no espere más de 24 horas para empezar la estimulación de células B). (Continuar con B.)
B. murino CD40-B de cultivo celular
I. Preparación de esplenocitos de CD40-estimulación (día 0):
Tenga en cuenta: antes de continuar asegurarse de que las células alimentadoras son adherentes. Siempre agregue nuevas soluciones de forma inmediata murino interleucina-4, β-mercaptoetanol y la ciclosporina A para el medio de cultivo antes de su uso.
- Diseccionar el bazo de los ratones C57BL / 6 (haplotipo H-2b) y lavar dos veces en 10-20 ml de DMEM suplementado con gentamicina [15μg/mL] mediante la transferencia con una punta de pipeta 10 ml de un tubo a otro. Evitar la transferencia de contaminantes (por ejemplo, pelo) del ratón. Picar el bazo pasándolo por un colador celular (100μm) y enjuague con otro tamiz de 10 ml de medio. Centrifugar a 265 xg esplenocitos durante 7 minutos a temperatura ambiente, a volver a suspender en 7 ml muCD40-B medio celular, los linfocitos y por separado por centrifugación de densidad Ficoll. Para ello las células de la capa de 5 ml de ratón Pancoll (precalentado a temperatura ambiente) en un tubo de 15 ml y centrifugar a 450 xg durante 30 minutos sin freno a temperatura ambiente.
- Extraiga la mayor parte de la capa superior, dejando la capa de linfocitos sin problemas en la interfaz. La transferencia de la capa de linfocitos a un tubo fresco mL 50, lavar una vez con 30 ml de DMEM con Gentamicina [15μg/mL] girando hacia abajo a 265 g durante 7 min para eliminar otras células. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de mCD40-B medio de lavado. Determinar el número de células en una parte alícuota de la suspensión celular. Determinar el número de células por contar una alícuota de la suspensión celular.
- Decantar la cantidad necesaria de células a 265 xg durante 7 minutos. Para una placa de 6 pocillos 5 x 10 6 células / así se necesitan, por lo tanto 30 x 10 6 células por placa.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender los linfocitos a 1,25 x 10 6 células / ml en mCD40 B-medio de cultivo fresco suplementado con 1 U / mL de IL-4 como factor de crecimiento, 100 mM β-mercaptoetanol y 0,63 mg / ml de ciclosporina A para prevenir la consecuencia de las células T (las concentraciones indicadas se refieren a un medio de cultivo ml!).
- Eliminar el sobrenadante de la placa de 6 pocillos pre-incubadas con células HeLa tmuCD40L.
- Suavemente agregar 4 ml de la suspensión de linfocitos (1,25 x 10 6 células / ml) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2. El día 3 reculture las células (Continúe con II.1.).
II. Subcultura de células mCD40B (días 3 y luego dos veces por semana):
- Cosecha mCD40B grupo de células vigorosamente pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 10 ml y la piscina que en un tubo de 50 ml.
- Centrifugar a 265 xg durante 7 minutos y sustituir por completo el sobrenadante con mCD40-B medio de lavado. Al contar la cantidad de células de una parte alícuota, girar las células hacia abajo a 265 xg durante 7 minutos. Resuspender las células en mCD40B mCD40 B-medio de cultivo a una concentración de 0,75 x 10 6 células / ml.
- Añadir nuevas soluciones de murino interleucina-4 en una concentración de 1 U / mL, 100 mM β-mercaptoetanol y 0,63 mg / ml de ciclosporina A en el medio.
- Eliminar el sobrenadante de una placa de 6 pocillos pre-incubadas con células HeLa irradiados tmuCD40L.
- Suavemente agregar 4 ml de la suspensión celular mCD40B (0,75 x 10 6 células / ml) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Incubar las placas a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Una vez más la subcultura de las células cada 3-4 días para terminar con alta pureza células murinas B CD40-activa después de un total de 14 días.
C. Solución de problemas: ¿Qué pasa si CD40-células B no crecen?
- ¿Ha revisado para la expresión del ligando CD40 de células alimentadoras?
- Son las células de alimentador de placas con destino utilizados para la estimulación de más de 24 horas?
- ¿Existe una contaminación por micoplasma?
- Era la solución de interleuquina-4 utilizado para la suplementación recién descongelado y lo tienen la actividad biológica apropiada?
- Fue β-mercaptoetanol y ciclosporina A agregado en la concentración correcta?
Figura 1a.
Figura 1b.
Figura 1d.
Figura 2.
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Discussion
Las modificaciones de este protocolo son posibles, especialmente en relación con el origen de CD40-estímulo y el tipo de cepa de ratón utilizada, también está dando en la generación eficiente de las células B CD40 murino activado. Ahmadi et al. han mostrado resultados similares para los fibroblastos de ratón transfectadas con CD40 murino-ligando. En este contexto de la presentación de xeno-antígeno puede ser excluido con certeza, pero los estudios intensivos sobre la seguridad y la toxicidad in vivo no da señales de reacción inflamatoria o de auto inmunidad en este contexto el uso humano las células HeLa transfectadas. Sin embargo, la mejor alternativa representa una murino soluble CD40-ligando con la activación y proliferación de la actividad, al mismo tiempo, que es a nuestro entender no están comercialmente disponibles.
Este protocolo también trabaja para los linfocitos de los ratones 129S2/SvPas (haplotipo H-2b), pero no ha sido evaluada por cepas de ratón más hasta ahora. Por otra parte las diferencias en el ajuste de la densidad celular, la concentración de citoquinas, la duración del tratamiento de ciclosporina A, los medios de cultivo celular y los platos también puede conducir a una eficiente CD40-activación de las células B murinas con las tasas de proliferación similares. Sin embargo, el trabajo intensivo se ha gastado en la optimización de este sistema de activación y la maximización de las tasas de proliferación resultante en el sistema actual.
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Disclosures
Los experimentos fueron realizados de acuerdo con las directrices nacionales y europeas para la cría de animales de laboratorio. Refiriéndose a la ley de bienestar animal alemán los animales fueron controlados periódicamente por las autoridades competentes.
Acknowledgments
Amablemente las gracias al Dr. Clemens Wendtner para proporcionar tmuCD40-ligando línea celular HeLa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-Glutamine, 300 μg/mL | |||
| FBS, 10% | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| Hygromycin B, 0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B washing medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B culture medium | |||
| D-MEM | |||
| L-Glutamine, 580 μg/mL | |||
| Glucose, 4.5 mg/mL | |||
| HEPES, 10 mM | |||
| Gentamycin, 15 μg/mL | |||
| MEM, 0.1mM (1x) | |||
| FBS, 10% | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM NEAA | Invitrogen | REF 11140 | |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| Recombinant Murine Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
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