Summary
자세한 프로토콜은 이미징을 위해 DNA 수리 단지의 실시간 형성을 설명
Abstract
모두 prokaryotes와 eukaryotes는 생리적 변화 복잡한 설정을 통해 DNA 손상에 대응. 유전자 표현, 기존의 단백질의 재배포, 새로운 단백질 단지의 어셈블리에 변경이 DNA의 병변과 일치하지 않는 DNA 기본 쌍 다양한 자극에 의해 수 있습니다. 형광 현미경은 DNA의 병변과 살아있는 세포의 복잡한 subcellular 구조 내의 DNA 복제 상태를 모니터링하기 위해 이러한 행위나 기타 가능한 답변을 시각화하고 quantifying을위한 강력한 실험 도구로 사용되고 있습니다. 형광 기자 단백질과 DNA 복제 및 복구 기계의 구성 요소 사이의 Translational fusions는 단서를 결정하는 데 사용되었다는 그들의 동족의 병변을 대상 DNA 수리 단백질
Protocol
현미경에 대한 세포의 성장 문화
1. 하루나 이틀 전에 영상에, B. 준비 subtilis는 시각화하려는 translational 융합 단백질을 포함하는 변형. 단계 1A와 1B의 평가판 반올림 성장 상태가 변형 최고의 영상을 제공하는 결정하기 위해 필요합니다. 대부분의 경우, 세포는 지수 성장 단계에서 몇 군데해야합니다.
- 일부 B. 들어 subtilis의 변종 (때문에 그 내생 로커스에 관심과 GFP의 유전자 사이의 translational 융합의 통합이 저조한 성장 특히, 종자)를, 이전 이미지로 이틀 동안 초기 성장은 높은 품질의 이미지가 필요합니다. 첫 날, 승리 B. subtilis는 선택적 항생제 (S)와 LB 한천에 몇 군데로 부담하고 30 ° C.에 밤새 품어 두 번째 날, 하나의 식민지와 0.85 %의 식염수 100 μl를 예방하고 30 하룻밤 배양하여 다음 각 희석 100 μL를 도금 LB 한천 플레이트 세 10 배 시리얼 dilutions (선택적 항생제), ° C. 수행 셋째 날, 세포의 빛을 합류 성장과 희석 접시를 선택합니다. 접시에 라이트 합류 성장 가능성 (4 단계 참조) 우수한 이미징 결과를 얻을 수있는 건강, 기하 급수적으로 증가 스타터 inoculum로 성장 매체를 제공합니다. 이 단계는 얼룩 FM4 - 64과 함께 최고 품질의 막 영상에 특히 유용합니다.
- 기타 B. subtilis의 변종은 단순히 살균 막대 사전 이미징에 하루 하나의 식민지에 대한 선택적 LB 한천 배지에 적용하고 30 ° C.에서 밤새 품어 수 있습니다 그 다음날,이 접시에 전지 (4 단계 참조) 이미징을위한 inoculum로 사용하기에 충분합니다.
참고 : B. 위해 subtilis은 액체 매체 야간 문화로 인해 지연 위상 성장 1 장기간의 원인이됩니다 포자 형성 및 쿼럼 응답의 조합에 해당되지 않습니다.
2. 영상, 125 ML 살균 Erlenmeyer 플라스크에 S7 50 1-3 매체의 장소 10 ML의 아침.
3. inoculum를 얻는 최대 단일 콜로니 또는 가벼운 합류 세포와 LB 한천 플레이트에서 S7 50 중간 2 ML에 세포를 Resuspend.
4. 0.1 ~ 0.08 600 NM에서 측정 초기 광학 밀도 (OD 600)와 문화를위한 10 ML S7 50 매체를 포함하는 Erlenmeyer 플라스크 충분한 S7 50 중간 세포 inoculum을 추가합니다. 이 단계에서 적어도 10 배 공기 매체 비율을 가지고하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 125 ML Erlenmeyer 플라스크에 주사 매체의 10-12.5 ML을 사용합니다.
5. 문화 OD 600에게 ~ 0.5-0.8에 도달할 ° C까지 30 각 문화를 성장. 떨고 물 욕조는 150-200에서 분당 회전과 선호하고 있습니다. DNA 손상이나 불일치 유도 요원과 도전 문화는 초기 기하 급수적인 성장 단계에서해야 OD 600 세포 (표 1 참조) 치료를 위해 필요한 성장의 추가 기간 OD 600 목표에 도달할 것으로 예
예를 들어, 2 aminopurine 한 치료 시간 때문에 2 aminopurine 대우 문화, OD 600 ~ 0.3-0.4에서 해당 OD 600에서 치료 / 성장 결과의 한 시간 정도 ~ 0.5-0.8 같은되어야 필요 의하여 세포 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
샘플 준비
1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 교양 세포의 피펫 300 μl.
2. 세포 세포막의 이미지가 원하는 경우, 1 MG / ML 재고 솔루션에서 각 샘플에 얼룩 FM4 - 64 멤브레인 (Invitrogen)를 1:1000 희석를 추가합니다. FM4 - 64의 적정가 원하는 형광 신호를 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 일반적인 적정 범위는 1:100, 1:1000, 그리고 1:10,000이다.
3. 아래에 설명된대로 슬라이드 1X Spizizens 매체에 1퍼센트 아가로 오스와 함께 준비하는 동안 시료가 10 분 또는 상온에서 앉아 ( "슬라이드 준비"의 1 단계 참조) 허용합니다.
4. 세포의 농도가 필요한 경우, 우리는 진공 장치와 필터 0.2 μm의를 사용하여 필터링 세포를 선호합니다. 전지는 부드럽게 PBS 다른 적절한 버퍼 또는 시각화하기 전에 매체와 필터의 표면에서 세탁하실 수 있습니다.
슬라이드 준비
1. 1X Spizizens와 1% 아가로 오스를 준비합니다.
5 0.5 g 아가로 오스와 함께 10X Spizizens 주식의 45 ML ML ddH2O하고, 녹기 전자 레인지를 추가합니다. 뜨거운 용융 아가로 오스는 피펫하기 어려운이며, 아가로 오스는 피펫 팁을 입력하지 않습니다 확정. 아가로 오스는 ° C 피펫 팁을 입력에 대한 내 응고없이 ~ 55-65의 온도로 물을 욕조에 equilibrated되어야합니다 팁.
2. 피펫 팁에 1퍼센트 녹아 아가로 오스와 Spizizens 20 μl을 그립니다. 얕은 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 잘 각 슬라이드 (우리는 15 자 슬라이드를 사용하여 표 2 참조)에 아가로 오스 솔루션의 한 방울 (약 1-2 μL)를 피펫. 아가로 오스는 즉시 고체화됩니다. 슬라이드도 세포의 응용 프로그램에 즉시 이전에하셔야합니다. 아가로 오스 패드가 혼자 실온에서 왼쪽으로있다면, 그들은 분 이내 탈수하고 사용할 수 없게 될 수 있습니다.
아가로 오스 패드가 중심하고 각각 기입 잘하지만 coverslip을 방해하지 않도록 최소 높이를해야; 방울이 (거품처럼) 너무 높다거나 예제에서는 잘 경계 너머 펼쳐지면, 간단하게 닦은 Kimwipe로 잘 청소면을 적용 새로운 아가로 오스 패드.
3. 각각의 아가로 오스 패드의 상단에 배포 슬라이드로 전체 300 μl 샘플을 (6 단계 참조) 적용합니다. 세포의이 금액은 슬라이드의 각 우물을 커버하기에 충분해야합니다.
4. 약 10 분 (23 ° C) 실온에서 앉아 세포와 함께 로드된 슬라이드를 허용합니다. 이 단계는 아가로 오스 패드는 이미지에 대한 고정되어 준비되기에 정착하는 세포 수 있습니다. 온도 변화 4 필요한 실험을 수행할 때 전문적인 요구에이 온도 예를 들어, 변경해야 할 수 있습니다.
5. 패드 스스로를 제거하지 않고 각각의 우물에서 초과 매체를 멀리 대기음.
6. 슬라이드 영역에 걸쳐, 부드럽게 확고하게하고 균일하게 눌러하지만, 슬라이드로 coverslip을 적용합니다. 커버 슬립이 슬라이드 반대하고 커버 용지가 슬라이드 위에 제기하지되었는지 확인하십시오.
세포의 시각화
1. 여러 다른 형광 현미경은 잘 작동합니다. 그것은 100X 기름 침지 렌즈를 가지고하는 것이 중요합니다. 시몬스 랩 사용합니다
- 1,45 NA TIRFM 100X 오일 침지 목적 렌즈가 장착된 올림푸스 BX61 현미경
- 하마 마츠 ORCAR이 CCD는 카메라를 냉각
- 루멘 200 아크 금속 (이전) 광원.
- GFP (FITC), 필터 여기 460-500과 510-560의 배출 감지
- FM4 - 64 (TRITC), 필터 여기 510-560과 572-648의 배출 감지.
- 이미지 SlideBook 4.2 (그림 1)를 사용하여 캡처한되었습니다
2. 하얀 빛을 이용하여 초점에 세포를 가져와.
3. 각 형광단에 맞는 필터를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
대표 결과
대표 이미지 (그림 1)과 같습니다. FM4 - 64 얼룩은 4-7 밝고 명확해야하는 동안 GFP foci는 잘 정의되어야한다. GFP 또는 막 이미지는 모든 데이터의 손실없이 제시하는 최고 품질의 이미지를 수 있도록 모든 색상과 유사 색 수 있습니다.
그림 1 : B. 대표 GFP 이미지 FM4 - 64 멤브레인 얼룩이 빨간색으로 표시되는 동안 subtilis translational 융합 단백질을. GFP 단백질은 녹색으로 표시됩니다. 흰색 스케일 바는 3 μm의을 나타냅니다 (A) MutS - GFP [관련 유전자형 : mutS - GFP (SPC), amyE : Pspac mutL (CAT)]. 600 μg / ML 2 aminopurine 1 MM의 IPTG의 존재 인치 FM4 - 64 신호가 더 명확하게 MutS - GFP foci를 표시하기 위해 표시하지 않습니다 (B) MutL - GFP [관련 유전자형 : mutL : mutL - GFP (SPC)].. 2 - aminopurine의 존재에 (C) DnaX - GFP [관련 유전자형 : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [관련 유전자형 : recA : recA - GFP (SPC)] 20의 존재에 NG / ML mitomycin C. (E) TagC - GFP [관련 유전자형 : tagC : tagC - GFP (SPC) ] 1 μg / ML mitomycin C. 앞에서
| 트리 트먼트 / 농도 또는 양을 | 기능 | 부화의 시간 |
| Mitomycin C (MMC) [20-150 NG / ML] | DNA는 에이전트 alkylating | 일시간 |
| 2 aminopurine (2 - AP) [600 μg / ML] | 불일치 유도 | 일시간 |
| Hydroxyurea (HU) | dNTPs를 depletes | 삼시간 |
| 자외선 (UV) 20 J/m2 | Thymine - thymine dimers의와 6-4 photoproducts | 20초 일반적으로, 소스에 따라 다릅니다 |
| 그라 이스 (이온화 방사선) 5-100 쥐 | 더블 스트랜드 나누기, 단일 스트랜드 휴식 및 기본 피해 사이트 | 소스에 따라 다릅니다 |
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| Multitest 슬라이드 15 - 글쎄요 | MP의 Biomedicals | 6041505E | |
| 현미경 커버 유리 | 어부 | 12-544 - B | |
| 아가로 오스 | 어부 | BP160 - 500 | |
| Mitomycin C | 시그마 | M0503 - 2MG | mutagen, 마모 장갑 |
| 2 Aminopurine | 시그마 | A3509 - 250MG | 장갑 |
| Hydroxyurea | 시그마 | H8627 - 25G | 장갑 |
| FM4 - 64 | Invitrogen | T13320 | 민감한 빛 |
표 2. 특정 시약 및 장비 목록 :
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Discussion
시행 착오는 각 변형에 대한 최고 품질의 이미지에 대한 노출 조건을 찾을 필요, 100-2000 MS의 노출은 GFP (FITC)와 FM4 - 64에 적합한 반면 우리는 1 밀리초는 하얀 빛을 이미지에 적합한 것을 발견 (TRITC ) 이미지. 노출 시간은 사용되는 이미징 장비에 따라 달라집니다. 여러 변종이 동일한 슬라이드에있는 경우에는 패드 국경에서 세포의 패드 품질과 확산은 스트레인 차별 복잡있을 수 있기 때문에 우리는 가장 간단한 영상 15 - 잘 현미경 슬라이드 당 하나의 변형의 사용을 권장합니다. 이미지 품질을 직접 박테리아가 휴식하는 아가로 오스 패드의 품질에 따라 달라집니다. 박테리아가 나란히 위치를 최고 품질의 이미지는 아가로 오스 패드에서 캡쳐한 것입니다. monolayer 방지, 클럼프에 박테리아 세포의 원인이 패드는, 가난한 이미지를 생성합니다. 탈수 아르 패드가 제대로 휴식 세포를 허용하지 않습니다 반면 너무 두께 패드는 높은 배경 형광 신호를 생산합니다. 이 아가로 오스 패드 결함은 일반적으로 매우 좋지 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 우물이 가난한 이미지를 제작하는 경우, 단순히 잘 다음으로 이동하십시오. 그것은 이미지 당 50 세 200 세포를 캡처하는 이상적입니다. 형광 현미경은 생체내에 foci로 DNA 복구 및 복제 단백질의 어셈블리를 직접 세포 신호를 자세히 풍부한 정보를 제공하고 있습니다. 연습을 통해이 기법이 성공적으로 여러 세균 종의 단백질 단지 다양한 적용할 수 있습니다.
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Acknowledgments
저자 DRS 감사하고 싶습니다. 처음 형광 현미경으로 마이크로 훈련을위한 Philina S. 리 앨런 D. 그로스맨. 저자는 또한 DRS 감사합니다. 도움말 및 팁 이미징 용 멜라니 Berkmen와 하지메 고바야시. 이 작품은 문학, 과학 예술 대학에서와 미시간 대학에서 분자 세포 및 발달 생물학의학과에서 자금 업을 시작하여 지원했다.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
