Summary
एक विस्तृत प्रोटोकॉल इमेजिंग के लिए डीएनए की मरम्मत परिसरों के वास्तविक समय में गठन में वर्णित है
Abstract
दोनों prokaryotes और eukaryotes शारीरिक परिवर्तनों का एक जटिल सेट के माध्यम से डीएनए की क्षति का जवाब. जीन अभिव्यक्ति, मौजूदा प्रोटीन के पुनर्वितरण, और नए प्रोटीन परिसरों की विधानसभा में बदलाव डीएनए घावों और बेमेल डीएनए आधार जोड़े की एक किस्म के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी visualizing और बढ़ाता डीएनए घावों और जटिल subcellular वास्तुकला के भीतर एक जीवित कोशिका के डीएनए प्रतिकृति स्थिति की निगरानी के लिए इन और अन्य प्रतिक्रियाओं के लिए एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. यह फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन और डीएनए प्रतिकृति और मशीनरी की मरम्मत के घटकों के बीच translational fusions cues निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि लक्ष्य डीएनए उनके आत्मीय घावों की मरम्मत प्रोटीन
Protocol
माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं के बढ़ते संस्कृतियों
1. इमेजिंग के लिए पहले एक या दो दिन, बी तैयार subtilis आप कल्पना करना चाहते हैं translational संलयन प्रोटीन युक्त तनाव. कदम 1A और 1B के ट्रायल के दौर जो विकास हालत अपने तनाव का सबसे अच्छा चित्र प्रदान करता है है निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. ज्यादातर मामलों में, कोशिकाओं के घातीय वृद्धि के चरण के दौरान imaged किया जाना चाहिए.
- कुछ बी के लिए subtilis (विशेष उपभेदों, और अपनी अंतर्जात ठिकाना पर ब्याज GFP के जीन के बीच translational संलयन के एकीकरण के कारण खराब बढ़ने में) उपभेदों, इमेजिंग के लिए पहले दो दिनों के लिए प्रारंभिक विकास उच्च गुणवत्ता छवियों के लिए आवश्यक है. पहले दिन, लकीर बी subtilis लेग अगर पर चयनात्मक एंटीबायोटिक (ओं) के साथ imaged किया जा तनाव और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते दूसरे दिन, एक एकल कॉलोनी के 0.85% खारा के साथ 100 μl टीका लगाना और तीन लेग अगर प्लेटों पर 10 गुना धारावाहिक dilutions (चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ), प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μL चढ़ाना, ऊष्मायन द्वारा 30 पर रातोंरात बाद डिग्री सेल्सियस प्रदर्शन तीसरे दिन, कोशिकाओं के प्रकाश मिला हुआ विकास के साथ कमजोर पड़ने की थाली का चयन करें. एक थाली पर हल्की मिला हुआ विकास एक स्वस्थ, तेजी से बढ़ रही स्टार्टर के लिए संभावित उत्कृष्ट इमेजिंग परिणाम (चरण 4 देखें) inoculum के साथ मध्यम विकास प्रदान करेगा. यह कदम दाग FM4-64 के साथ उच्चतम गुणवत्ता झिल्ली इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
- अन्य बी subtilis उपभेदों बस एक बाँझ इमेजिंग के लिए पहले दिन छड़ी के साथ एकल कालोनियों के लिए चयनात्मक लेग अगर माध्यम से हो सकता है लागू किया जा और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते अगले दिन, इस थाली पर कक्षों इमेजिंग के लिए एक inoculum के रूप में (चरण 4 देखें) का उपयोग करने के लिए पर्याप्त हो जाएगा.
बी के लिए: नोट subtilis, तरल माध्यम में रात भर संस्कृतियों के कारण बीजाणु गठन और कोरम प्रतिक्रियाओं का एक संयोजन जो अंतराल चरण 1 विकास की एक विस्तारित अवधि के कारण होगा करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं .
2. इमेजिंग, जगह S7 50 125 एमएल बाँझ Erlenmeyer फ्लास्क में 1-3 मध्यम की 10 एमएल की सुबह.
3. कोशिकाओं एकल कालोनियों या प्रकाश मिला हुआ कोशिकाओं के साथ लेग अगर थाली से 2 S7 के 50 माध्यम से एमएल inoculum प्राप्त Resuspend .
4. Erlenmeyer 600 एनएम पर मापा एक प्रारंभिक ऑप्टिकल घनत्व (600 आयुध डिपो) 0.08 ~ 0.1 के साथ एक संस्कृति के लिए 10 एमएल S7 के 50 मध्यम युक्त कुप्पी के लिए पर्याप्त S7 के 50 मध्यम सेल inoculum जोड़ें. इस चरण में यह महत्वपूर्ण है कम से कम 10 गुना हवा मध्यम अनुपात करने के लिए है. इस प्रकार, हम 125 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में inoculated माध्यम के 10 12,5 एमएल का उपयोग करें.
5. 30 में प्रत्येक संस्कृति विकसित करने डिग्री सेल्सियस जब तक संस्कृति एक आयुध डिपो 600 0.5-0.8 ~ तक पहुँचता है . हिलती पानी स्नान के 150-200 प्रति मिनट से क्रांतियों के साथ पसंद कर रहे हैं. हानिकारक डीएनए या बेमेल उत्प्रेरण एजेंटों के साथ चुनौती दी संस्कृतियों को एक प्रारंभिक घातीय वृद्धि चरण में होना चाहिए 600 आयुध डिपो जैसे आयुध डिपो 600 कि कोशिकाओं है कि इलाज के लिए आवश्यक है विकास की अतिरिक्त अवधि के साथ लक्ष्य पहुँच जाएगा (देखें तालिका 1)
उदाहरण के लिए, 2-aminopurine उपचार के एक घंटे, और इसलिए एक 2 - aminopurine के साथ इलाज संस्कृति 600 आयुध डिपो 0.3-0.4 ~ में हो सकता है, कि इस तरह के उपचार / 600 आयुध डिपो में वृद्धि के परिणाम की एक घंटे ~ 0.5-0.8 होना चाहिए की आवश्यकता है, कोशिकाओं इमेजिंग के लिए तैयार जिससे हैं.
नमूना तैयार
1. पिपेट एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में संवर्धित कोशिकाओं के 300 μl.
2. यदि सेलुलर झिल्लियाँ की इमेजिंग वांछित है, एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से प्रत्येक नमूना FM4-64 दाग झिल्ली (Invitrogen) के 1:1000 कमजोर पड़ने जोड़ने. FM4-64 के एक टाइट्रेट करना के लिए वांछित प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. एक ठेठ अनुमापन रेंज 1:100, 1:1000, और 1:10,000 है.
3. नमूने को दस मिनट तक के लिए या कमरे के तापमान पर बैठते हैं जबकि स्लाइड 1X Spizizens मध्यम में किया जा रहा है 1% agarose के साथ तैयार के रूप में नीचे वर्णित ("स्लाइड तैयारी" के चरण 1 देखें) की अनुमति दें.
4. यदि कक्षों की एकाग्रता की आवश्यकता है, हम फ़िल्टरिंग एक निर्वात उपकरण के साथ एक 0.2 फिल्टर सुक्ष्ममापी कोशिकाओं का उपयोग करना पसंद करते हैं. कक्ष फिर धीरे Pbs, अन्य उपयुक्त बफर या दृश्य से पहले मध्यम के साथ फिल्टर की सतह से धोया जा सकता है.
स्लाइड तैयार
1. 1X Spizizens के साथ 1% agarose तैयार करें.
5 एमएल 10X Spizizens स्टॉक के 0.5 ग्राम agarose के साथ साथ 45 मिलीलीटर ddH2O और पिघल माइक्रोवेव जोड़ें. गरम पिघला हुआ agarose विंदुक मुश्किल है, और जम agarose विंदुक टिप में प्रवेश नहीं करेगा. agarose एक पानी के स्नान में equilibrated भीतर solidifying बिना डिग्री सेल्सियस इसके लिए विंदुक टिप दर्ज ~ 55-65 के एक तापमान करने के लिए किया जाना चाहिए टिप.
2. विंदुक टिप में 1% पिघला agarose साथ Spizizens के 20 μl ड्रा. पिपेट agarose समाधान के एक एकल (लगभग 1-2 μL) अच्छी तरह से प्रत्येक स्लाइड (हम 15 अच्छी तरह से स्लाइड्स का उपयोग करें, तालिका 2 देखें) उथले agarose पैड फार्म में ड्रॉप. agarose तुरंत कठियाना जाएगा. स्लाइड्स भी तुरंत कोशिकाओं के आवेदन करने से पहले बनाया जाना चाहिए. यदि agarose पैड अकेले कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है, वे मिनट के भीतर निर्जलीकरण और बेकार हो सकते हैं.
Agarose पैड केन्द्रित किया और प्रत्येक को भरने चाहिए, लेकिन अच्छी तरह coverslip में खलल न डालें से बचने के लिए न्यूनतम ऊंचाई है, अगर बूंदों भी उच्च (बुलबुले की तरह) हैं या अगर नमूना अच्छी तरह से सीमा से परे से फैलता है, बस अच्छी तरह से एक Kimwipe के साथ स्वच्छ ज़ोर से मारना और लागू नए agarose पैड.
3. स्लाइड, प्रत्येक agarose पैड के शीर्ष पर वितरित करने के लिए पूरे 300 μl नमूना (कदम 6 देखें) लागू करें. कक्षों की यह राशि स्लाइड पर हर अच्छी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
4. कोशिकाओं के साथ लोड करने के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं (23 डिग्री सेल्सियस) लगभग दस मिनट के लिए स्लाइड की अनुमति दें. यह कदम agarose पैड स्थिर और इमेजिंग के लिए तैयार होने पर व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं के लिए अनुमति देगा. विशेष जरूरतों के लिए इस तापमान उदाहरण के लिए, परिवर्तित करने की आवश्यकता जब प्रदर्शन प्रयोगों है कि एक तापमान चार बदलाव की आवश्यकता हो सकता है.
5. दूर पैड खुद को हटाने के बिना प्रत्येक अच्छी तरह से अधिक मध्यम Aspirate.
6. स्लाइड coverslip लागू, दृढ़ता और समान दबाव, लेकिन धीरे स्लाइड के क्षेत्र में. लगता है कि कवर पर्ची स्लाइड के खिलाफ है और कवर पर्ची स्लाइड ऊपर नहीं उठाया है कि जाँच करें.
कक्षों के दृश्य
1. कई अलग प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में अच्छी तरह से काम करेगा. यह एक 100X तेल विसर्जन लेंस के लिए महत्वपूर्ण है. सीमन्स लैब का उपयोग करता है:
- ओलिंप BX61 1,45 एनए TIRFM 100X तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित खुर्दबीन
- हमामात्सू ORCAR 2 सीसीडी कैमरा ठंडा
- लुमेन 200 चाप (पहले) धातु प्रकाश स्रोत.
- (FITC) GFP, फिल्टर उत्तेजना 460-500 और 510-560 उत्सर्जन का पता लगाने के के लिए
- (TRITC) FM4-64, फिल्टर उत्तेजना 510-560 और 572-648 उत्सर्जन का पता लगाने के लिए.
- छवियाँ 4.2 SlideBook (चित्रा 1) का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया
2. श्वेत प्रकाश का उपयोग करते हुए ध्यान में कोशिकाओं लाओ.
3. प्रत्येक fluorophore के लिए उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर छवि पर कब्जा.
प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि छवियाँ (चित्रा 1) दिखाए जाते हैं. GFP foci अच्छी तरह से परिभाषित हो सकता है, जबकि FM4-64 धुंधला उज्ज्वल और स्पष्ट 4-7 होना चाहिए. GFP या झिल्ली छवियों छद्म रंग किसी भी रंग के साथ हो सकता है, के लिए उच्चतम गुणवत्ता छवि के लिए किसी भी डेटा खोने के बिना प्रस्तुत किया के लिए अनुमति देने के लिए कर सकते हैं.
चित्रा 1: बी के प्रतिनिधि GFP छवियों subtilis translational संलयन प्रोटीन GFP प्रोटीन हरे रंग में दिखाया गया है, जबकि FM4-64 झिल्ली धुंधला लाल रंग में दिखाया गया है . 600 μg / 2 aminopurine एमएल और 1 मिमी IPTG की मौजूदगी में:: सफेद पैमाने बार 3 सुक्ष्ममापी (ए) MutS - GFP [Pspac (बिल्ली) mutL GFP (SPC), amyE mutS प्रासंगिक जीनोटाइप] इंगित करता है. FM4-64 संकेत के क्रम में और अधिक स्पष्ट रूप से MutS - GFP foci शो प्रस्तुत नहीं है (बी) MutL GFP [प्रासंगिक जीनोटाइप: mutL:: mutL GFP (SPC)] 2 - aminopurine की उपस्थिति में (सी) DnaX GFP [प्रासंगिक जीनोटाइप: dnaX: dnaX (SPC) GFP]. (डी) RecA - GFP [प्रासंगिक जीनोटाइप: recA: recA (SPC) GFP] 20 की उपस्थिति में एनजी / एमएल mitomycin सी. (ई) TagC GFP [प्रासंगिक जीनोटाइप: tagC: tagC - GFP (SPC) ] 1 μg / एमएल mitomycin सी. की उपस्थिति में
| उपचार / एकाग्रता या राशि | समारोह | ऊष्मायन समय |
| Mitomycin सी (एमएमसी) [20 150 एनजी / एमएल] | डीएनए एजेंट alkylating | 1 घंटे |
| Aminopurine 2 (2 - एपी) [600 / μg एमएल] | बेमेल उत्प्रेरण | 1 घंटे |
| Hydroxyurea (एच यू) | dNTPs depletes | 3 घंटे |
| पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश J/m2 20 | थिमाइन थिमाइन dimers और 6-4 photoproducts | स्रोत पर निर्भर करता है, आमतौर पर 20 सेकंड है |
| grays (विकिरण) 5 100 Gy | डबल भूग्रस्त टूटता है, एकल भूग्रस्त टूटता है और बेस नुकसान साइटों | स्रोत पर निर्भर करता है |
| अभिकर्मक के नाम | कंपनी | सूचीपत्र संख्या | टिप्पणियां (वैकल्पिक) |
| Multitest स्लाइड, 15-अच्छी तरह से | सांसद Biomedicals | 6041505E | |
| माइक्रोस्कोप कवर ग्लास | मछुआ | 12 544 - बी | |
| Agarose | मछुआ | BP160 - 500 | |
| Mitomycin सी | सिग्मा | M0503-2mg | उत्परिवर्तजन, पहनने के दस्ताने |
| 2-Aminopurine | सिग्मा | A3509-250mg | दस्ताने |
| Hydroxyurea | सिग्मा | H8627 - 25g | दस्ताने |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | संवेदनशील प्रकाश |
तालिका 2. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की सूची:
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Discussion
परीक्षण और त्रुटि के लिए प्रत्येक तनाव के लिए उच्चतम गुणवत्ता छवियों के लिए जोखिम की स्थिति को खोजने के लिए आवश्यक हैं, हम पाते हैं कि एक millisecond सफेद प्रकाश छवियों के लिए उपयुक्त है, जबकि 100 से 2000 एमएस के जोखिम (FITC) GFP और FM4-64 के लिए उपयुक्त हैं (TRITC ) छवियों. एक्सपोज़र समय इमेजिंग उपकरणों का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. हम सरल इमेजिंग के लिए 15 अच्छी तरह खुर्दबीन स्लाइड के प्रति एक तनाव का उपयोग की सलाह देते हैं, के रूप में पैड और पैड सीमा से कोशिकाओं की गुणवत्ता प्रसार तनाव भेदभाव जटिल अगर कई उपभेदों के एक ही स्लाइड पर मौजूद हो सकता है. छवि गुणवत्ता को सीधे agarose पैड जहां बैक्टीरिया आराम कर रहे हैं की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. उच्चतम गुणवत्ता छवियों agarose पैड से कब्जा कर लिया जाएगा जहां बैक्टीरिया कंधे से कंधा मिलाकर कर रहे हैं. पैड है कि बैक्टीरियल कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट के लिए कारण है, एक monolayer को रोकने, गरीब छवियों का उत्पादन होगा. पैड कि भी मोटी हैं एक उच्च पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन, जबकि पैड कि निर्जलित हैं कोशिकाओं को ठीक से आराम करने के लिए अनुमति नहीं दी जाएगी. ये agarose पैड दोष आमतौर पर बहुत ही गरीब छवि गुणवत्ता में परिणाम होगा. यदि एक अच्छी तरह से गरीब छवियों का उत्पादन होता है, बस अच्छी तरह से अगले कदम पर. यह छवि प्रति 50 और 200 के बीच कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए आदर्श है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जानकारी का खजाना प्रदान की गई है सेलुलर संकेत है कि डीएनए और vivo में foci में मरम्मत प्रतिकृति प्रोटीन की विधानसभा प्रत्यक्ष का ब्यौरा . अभ्यास के साथ, इस तकनीक को सफलतापूर्वक कई बैक्टीरियल प्रजातियों में किया जा सकता है प्रोटीन परिसरों की एक किस्म के लिए लागू है.
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Acknowledgments
लेखकों के लिए डीआरएस का धन्यवाद करना चाहते हैं. Philina एस ली और शुरू में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में लास प्रशिक्षण के लिए एलन डी. ग्रॉसमैन. लेखकों को भी डीआरएस धन्यवाद. मेलानी Berkmen और इमेजिंग के लिए मदद और सुझावों के लिए Hajime कोबायाशी. यह काम साहित्य, विज्ञान और कला के कॉलेज से और मिशिगन विश्वविद्यालय में आण्विक सेलुलर, और विकासात्मक जीवविज्ञान विभाग से शुरू हुआ धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
