Summary
פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן דנ"א
Abstract
שני ו אאוקריוטים פרוקריוטים להגיב נזק לדנ"א באמצעות מערכת מורכבת של שינויים פיזיולוגיים. שינויים בביטוי הגנים, חלוקה מחדש של החלבונים הקיימים, ואת הרכבה של קומפלקסים חלבונים חדשים יכול להיות מגורה על ידי מגוון של נגעים דנ"א תואמים בסיס זוגות DNA. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש ככלי ניסיוני רב עוצמה המאפשר הדמיה לכימות תגובות אלה ואחרים נגעים דנ"א כדי לפקח על שכפול ה-DNA מעמד בתוך הארכיטקטורה subcellular המורכב של התא החי. Fusions Translational בין חלבונים כתב ניאון ורכיבים של שכפול ה-DNA ואת מנגנון תיקון שימשו כדי לקבוע את הרמזים כי ה-DNA היעד לתיקון חלבונים נגעים שלהם מאותו מקור
Protocol
גידול תרביות של תאים עבור מיקרוסקופיה
1. אחד או יומיים לפני ההדמיה, להכין את B. subtilis זן המכיל את החלבון היתוך translational אתם רוצים לדמיין. סיבובים משפט 1A ו-1B צעדים יהיה צורך לקבוע אילו תנאי גידול מספק את התמונות הטובות ביותר של זן שלך. ברוב המקרים, התאים צריכים להיות צילמו במהלך שלב הצמיחה המעריכית.
- עבור חלק ב ' subtilis זנים (ב, זנים מסוימים הגדלים גרוע עקב שילוב של היתוך translational בין הגן של ריבית ה-GFP על מוקד אנדוגני שלה), צמיחה ראשונית יומיים לפני הדמיה הוא הכרחי עבור תמונות באיכות גבוהה. ביום הראשון, פס ב subtilis להתאמץ כדי להיות צילמו על אגר LB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית (ים) ו דגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השני, לחסן 100 μl של 0.85% עם מלח מושבת יחיד לבצע שלוש דילולים סדרתי של פי 10 על צלחות אגר LB (עם אנטיביוטיקה סלקטיבית), ציפוי 100 μL של דילול כל, ואחריו הדגירה לילה בשעה 30 ° C. ביום השלישי, בחר את צלחת דילול עם צמיחה ומחוברות אור של תאים. צמיחה ומחוברות אור על צלחת תספק צמיחה בינוני עם inoculum בריא המתנע אקספוננציאלית גדל פוטנציאל להניב תוצאות הדמיה מעולה (ראה שלב 4). צעד זה שימושי במיוחד עבור הדמיה באיכות הגבוהה ביותר קרום עם כתם FM4-64.
- אחרים ב זנים subtilis יכול פשוט להיות מיושם בינוני אגר סלקטיבי LB עבור מושבות יחיד עם מקל סטרילי יום לפני הדמיה דגירה לילה בשעה 30 ° C. למחרת, תאים על הצלחת זה יהיה מספיק כדי לשמש inoculum הדמיה (ראה שלב 4).
הערה: לקבלת B. subtilis, תרבויות לילה במדיום נוזלי אינם מתאימים עקב שילוב של יצירת הנבגים ותגובות המניין, אשר יגרום תקופה ממושכת של צמיחה בפיגור שלב 1.
2. בבוקרו של הדמיה, מקום 10 מ"ל של מדיום 50 S7 1-3 לתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer סטרילי.
3. Resuspend התאים עד 2 מ"ל של מדיום 50 S7 מהצלחת LB אגר עם מושבות יחיד או בתאי אור ומחוברות להשיג inoculum.
4. הוסף מספיק S7 50 בינוני תא inoculum אל הבקבוק המכיל 10 מ"ל Erlenmeyer S7 50 בינוני תרבות עם צפיפות אופטית הראשונית נמדד ב 600 nm (OD 600) של ~ 0.08-0.1. בשלב זה חשוב לי לפחות אוויר של פי 10 יחס בינוני. לפיכך, אנו משתמשים 10-12.5 מ"ל של מדיום מחוסן בתוך בקבוק 125 מ"ל Erlenmeyer.
5. לגדול בכל תרבות ב 30 ° C עד התרבות מגיע OD 600 ~ 0.5-0.8. אמבטיות מים רועד עדיפים עם סיבובים לדקה 150-200. תרבויות תיגר עם סוכני ה-DNA אי התאמה או גרימת נזק צריך להיות בשלב מוקדם הצמיחה המעריכית OD 600 תאים כאלה יגיעו ליעד OD 600 לתקופה נוספת של צמיחה הנדרש לטיפול (ראה לוח 1)
לדוגמה, 2-aminopurine דורש שעה אחת של טיפול, ולכן תרבות שטופלו aminopurine-2 צריך להיות 600 ~ OD 0.3-0.4, כך שעה אחת של טיפול / תוצאות הצמיחה OD 600 ~ 0.5-0.8, לפיו תאים מוכנים הדמיה.
לדוגמא הכנה
1. פיפטה 300 μl של תאים בתרבית לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
2. אם הדמיה של ממברנות הסלולר הוא הרצוי, להוסיף 1:1000 דילול של קרום FM4-64 כתם (Invitrogen) לדגום כל מפתרון מ"ג / מ"ל 1 המניות. טיטרציה של FM4-64 עשויים להידרש כדי להשיג את אותות הקרינה הרצויה. מגוון טיטרציה טיפוסית היא 1:100, 1:1000, ו 1:10,000.
3. אפשר הדגימות לשבת בטמפרטורת החדר לתקופה של עד עשר דקות או בעוד שקופית מכינים עם agarose 1% בטווח הבינוני Spizizens 1X כמתואר להלן (ראה שלב 1 של "הכנת שקופית").
4. אם ריכוז של התאים נדרשת, אנו מעדיפים תאים סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר עם מנגנון ואקום. תאים לאחר מכן ניתן לשטוף בעדינות מפני השטח של המסנן עם PBS, עוד חיץ מתאים או בינוני לפני להדמיה.
הכנת שקופיות
1. הכן agarose 1% עם 1X Spizizens.
הוסף 5 מ"ל של המניה Spizizens 10X ל 45 מ"ל ddH2O יחד עם 0.5 גרם agarose, ומיקרוגל להינמס. Agarose מותכת חמה קשה פיפטה, ביסוס agarose לא ייכנסו קצה פיפטה. Agarose צריך להיות equilibrated באמבט מים בטמפרטורה של 55-65 ° C ~ את זה כדי להזין את קצה פיפטה ללא לחיזוק בתוך טיפ.
2. צייר 20 μl של Spizizens עם agarose מומסת 1% אל קצה פיפטה. פיפטה טיפה אחת (כ 1-2 μL) של הפתרון agarose לתוך שקופית היטב (אנחנו משתמשים גם 15 שקופיות, ראה טבלה 2) כדי ליצור רדוד רפידות agarose. Agarose יהיה לגבש באופן מיידי. שקופיות חייב להיות גם מיד לפני יישום של התאים. אם כריות agarose נותרים בטמפרטורת החדר לבד, הם יכולים תוך דקות מייבשים ולהיות שמיש.
רפידות agarose צריך להיות מרוכז ומלא כל טוב אבל יש גובה מינימום כדי למנוע שיבוש coverslip, אם הטיפות הן גבוהות מדי (כמו בועה) או אם המדגם מתפשט גם מעבר לגבול, פשוט לסחוב לנקות היטב עם Kimwipe ולהחיל חדש agarose כרית.
3. החל המדגם כולו 300 μl (ראה שלב 6) לשקופית, מופץ על החלק העליון של כל משטח agarose. זו כמות של תאים אמור להיות מספיק כדי לכסות את כל טוב בשקופית.
4. אפשר להחליק עמוסה התאים לשבת בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) במשך כ עשר דקות. צעד זה יאפשר את התאים להתיישב על כרית agarose להיות נייח ומוכן הדמיה. עבור צרכים מיוחדים בטמפרטורה זו ייתכן שיהיה צורך לשנות, למשל, בעת ביצוע הניסויים הדורשים שינוי הטמפרטורה 4.
5. לשאוב משם את המדיום עודף גם מבלי להסיר את כל הרפידות עצמם.
6. החל את coverslip לשקופית, לחיצה בחוזקה ובאופן שווה, אבל בעדינות, על פני שטח של השקופית. ודא כי להחליק כיסוי נגד לשקופית וכי להחליק לכסות לא עולה מעל השקופית.
ויזואליזציה של תאים
1. רבים מיקרוסקופים פלואורסצנציה שונים יעבדו היטב. זה קריטי יש עדשה 100x טבילה שמן. המעבדה סימונס משתמש:
- אולימפוס BX61 מיקרוסקופ המצויד 1,45 NA TIRFM העדשה 100x טבילה שמן אובייקטיבי
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD מקורר מצלמה
- Lumen 200 מתכת קשת (לפני) מקור אור.
- לצורך זיהוי של ה-GFP (FITC), עירור לסנן 460-500 ופליטה 510-560
- לצורך זיהוי של FM4-64 (TRITC), עירור לסנן 510-560 ופליטה 572-648.
- תמונות שנתפסו באמצעות SlideBook 4.2 (איור 1)
2. תביאו את התאים אל המוקד באמצעות אור לבן.
3. צלמו את התמונה באמצעות מסננים מתאים fluorophore כל אחד.
נציג תוצאות
תמונות נציג מוצגים (איור 1). GFP מוקדים צריך להיות מוגדר היטב, בעוד FM4-64 מכתים צריך להיות בהיר 4-7. תמונות GFP או קרום יכול להיות פסאודו בצבע עם כל צבע, על מנת לאפשר את התמונה באיכות הגבוהה ביותר שיוצגו מבלי לאבד נתונים.
איור 1: תמונות GFP נציג B. subtilis חלבונים היתוך translational. חלבוני ה-GFP מוצגים ירוק, בעוד מכתים FM4-64 ממברנה מוצג באדום. סרגל סולם לבן מציין 3 מיקרומטר (א) MutS-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutS - GFP (SPC), amyE: Pspac mutL (חתול)]. בנוכחותו של 600 מיקרוגרם / מ"ל 2-aminopurine ו IPTG 1 מ"מ. FM4-64 אות לא מוצגת על מנת להראות בצורה ברורה יותר MutS-GFP מוקדים (ב) MutL-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: mutL: mutL-GFP (SPC)].. בנוכחות aminopurine-2 (C) DnaX-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: dnaX: dnaX-GFP (SPC)]. (ד) RecA-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: recA: recA-GFP (SPC)] בנוכחות של 20 ng / mL mitomycin ג (E) TagC-GFP [גנוטיפ רלוונטיים: tagC: tagC-GFP (SPC) ] בנוכחות של 1 מיקרוגרם / מ"ל mitomycin ג
| טיפול / ריכוז או כמות | פונקציה | זמן הדגירה של |
| Mitomycin C (MMC) [20-150 ng / mL] | סוכן ה-DNA אלקילציה | 1 שעה |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 מיקרוגרם / מ"ל] | גרימת אי התאמה | 1 שעה |
| Hydroxyurea (האוניברסיטה העברית) | מכלה dNTPs | 3 שעות |
| אור אולטרה סגול (UV) 20 J/m2 | תימין, תימין הדימרים ו 6-4 photoproducts | משתנה בהתאם למקור, בדרך כלל 20 שניות |
| אפור (קרינה מייננת) 5-100 Gy | גדיל שוברת פעמיים, הפסקות גדיל יחיד נזק אתרי בסיס | משתנה בהתאם למקור |
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| שקופית Multitest, 15-היטב | MP Biomedicals | 6041505E | |
| כיסוי זכוכית מיקרוסקופ | דיג | 12-544-B | |
| Agarose | דיג | BP160-500 | |
| Mitomycin C | סיגמא | M0503-2MG | mutagen, ללבוש כפפות |
| 2-Aminopurine | סיגמא | A3509-טבליות של 250 | כפפות |
| Hydroxyurea | סיגמא | H8627-25 גרם | כפפות |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | אור רגיש |
טבלה 2. רשימת ריאגנטים ספציפיים ציוד:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניסוי וטעייה נדרשים למצוא את התנאים החשיפה לתמונות באיכות הגבוהה ביותר עבור כל זן, אנו מוצאים כי 1 אלפית השנייה מתאים תמונות אור לבן, תוך חשיפה של 100-2000 ms המתאימים GFP (FITC) ו FM4-64 (TRITC ) תמונות. זמן חשיפה ישתנו בהתאם לציוד הדמיה בשימוש. אנו ממליצים להשתמש זן אחד לכל שקופית 15 גם מיקרוסקופ הדמיה הפשוטה ביותר, כמו איכות פנקס דיפוזיה של תאים מהגבול כרית עלולה לסבך בידול זן אם זנים רבים נמצאים בשקופית אחת. איכות תמונה ישירות תלוי באיכות של כרית agarose שבו החיידקים נחים. התמונות באיכות הגבוהה ביותר יהיה שנתפסו מ agarose רפידות שבו חיידקים נמצאים זה לצד זה. רפידות שגורמים תאים חיידקיים אל סבך, מניעת monolayer, תפיק תמונות עניים. רפידות כי הם עבים מדי יפיק אות רקע גבוה פלורסנט, בעוד רפידות כי הם לא יאפשרו מיובש עבור התאים לנוח כמו שצריך. אלה כרית פגמים agarose יהיה בדרך כלל תוצאה של איכות תמונה גרועה מאוד. אם גם הוא לייצר דימויים עני, פשוט לעבור הבא היטב. הוא אידיאלי כדי ללכוד את בין 50 ל 200 תאים לכל תמונה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סיפקה שפע של מידע המפרט את הרמזים הסלולר לכוון את הרכבה של תיקון דנ"א וחלבונים שכפול לתוך מוקדי in vivo. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להיות מיושם בהצלחה במגוון רחב של קומפלקסים חלבונים במינים חיידקים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות בני הזוג. Philina ס לי אלן ד גרוסמן עבור בתחילה הכשרה LAS ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המחברים מודים גם בני הזוג. מלאני Berkmen ו האג'ימה קוביאשי לעזרה וטיפים הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי הזנק וקרנות מהמכללה, ספרות מדע אמנות מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית, נייד, ו התפתחותית באוניברסיטת מישיגן.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
