Summary
Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in
Abstract
Sia procarioti ed eucarioti rispondere a danni al DNA attraverso una complessa serie di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell'espressione genica, la redistribuzione delle proteine esistenti e l'assemblaggio di complessi proteici nuovo può essere stimolata da una varietà di lesioni del DNA e non corrispondenti coppie di basi del DNA. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato come un potente strumento sperimentale per visualizzare e quantificare le risposte a queste ed altre lesioni del DNA e per monitorare lo stato replicazione del DNA all'interno della complessa architettura subcellulare di una cellula vivente. Fusioni traduzionali tra proteine fluorescenti giornalista e componenti della replicazione del DNA e riparazione macchinari sono stati utilizzati per determinare i segnali che l'obiettivo del DNA proteine di riparazione delle lesioni ai loro affini
Protocol
Colture di cellule in crescita per microscopia
1. Uno o due giorni prima di imaging, preparare la B. subtilis ceppo contenente la proteina di fusione traslazionale che si desidera visualizzare. Turni di prova di 1A e 1B passi saranno necessari per determinare quale condizione di crescita fornisce le migliori immagini del vostro sforzo. Nella maggior parte dei casi, le cellule dovrebbero essere esposte durante la fase di crescita esponenziale.
- Per alcune B. ceppi subtilis (in particolare, i ceppi che crescono poco, grazie all'integrazione della fusione traslazionale tra il gene di interesse e GFP al suo locus endogena), la crescita iniziale per due giorni precedenti l'imaging è necessario per immagini di alta qualità. Il primo giorno, striscia la B. subtilis ceppo di essere ripreso su agar LB con antibiotico selettivo (s) e incubare una notte a 30 ° C. Il secondo giorno, inoculare 100 l di soluzione salina allo 0,85% con una singola colonia ed eseguire tre diluizioni di 10 volte seriale su piastre di agar LB (con antibiotici selettivi), placcatura 100 l di ogni diluizione, seguita dalla notte di incubazione a 30 ° C. Il terzo giorno, selezionare la piastra di diluizione con luce crescita confluente di cellule. Luce crescita confluente su un piatto fornirà il terreno di coltura con una sana e in crescita esponenziale inoculo starter per produrre potenzialmente ottimi risultati di imaging (vedi punto 4). Questa fase è particolarmente utile per l'imaging di altissima qualità a membrana con la macchia FM4-64.
- Altri B. ceppi subtilis possono semplicemente essere applicate a terreno selettivo agarizzato LB per singole colonie con un bastone sterile il giorno prima di imaging e incubare una notte a 30 ° C. Il giorno seguente, le celle su questa piastra sarà sufficiente utilizzare come inoculo per l'imaging (vedi punto 4).
NOTA: per B. subtilis, culture durante la notte in mezzo liquido non sono adatti a causa di una combinazione di formazione di spore e le risposte del quorum, che farà un lungo periodo di crescita ritardo di fase 1.
2. La mattina di imaging versare 10 ml di S7 50 media 1-3 in un pallone da 125 ml Erlenmeyer sterile.
3. Risospendere le cellule in un massimo di 2 ml di S7 50 di media dalla piastra LB agar con singole colonie o le cellule confluenti luce per ottenere un inoculo.
4. Aggiungi sufficiente S7 50 medio-cell inoculo per la beuta contenente 10 ml S7 50 di media per una cultura con una densità iniziale ottica misurata a 600 nm (OD 600) di ~ 0,08-0,1. A questo punto è importante avere almeno 10 volte l'aria al rapporto medio. Quindi, utilizziamo 10-12,5 mL di terreno inoculato in un pallone di 125 ml Erlenmeyer.
5. Crescono ogni cultura a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno 600 ~ 0,5-0,8. Bagni di acqua agitazione sono da preferire con giri al minuto da 150-200. Culture sfidato con gli agenti che danneggiano il DNA inducendo o mancata corrispondenza dovrebbe essere in una fase iniziale di crescita esponenziale OD 600 in modo tale che le cellule raggiungerà l'obiettivo OD 600 con l'ulteriore periodo di crescita che è necessario per il trattamento (vedi tabella 1)
Per esempio, 2-aminopurine richiede un'ora di trattamento, e quindi una cultura trattati con 2-aminopurine dovrebbe essere di 0,3-0,4 OD 600 ~, tale che l'un'ora di trattamento / risultati di crescita in un OD 600 ~ 0,5-0,8, per cui le cellule sono pronte per l'imaging.
Preparazione del campione
1. Pipettare 300 ul di cellule in coltura in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Se l'imaging delle membrane cellulari si desidera, aggiungere 1:1000 diluizione di FM4-64 membrana macchia (Invitrogen) per ogni campione da un mg / 1 ml soluzione madre. Una titolazione di FM4-64 può essere richiesto per ottenere il segnale di fluorescenza desiderato. Una gamma titolazione tipica è 1:100, 1:1000 e 1:10.000.
3. Lasciare i campioni a temperatura ambiente fino a una decina di minuti, mentre la diapositiva si sta preparando con 1% di agarosio in 1X medio Spizizens come descritto di seguito (vedi punto 1 di "preparazione del vetrino").
4. Se la concentrazione di cellule è richiesto, noi preferiamo celle filtranti con filtro da 0,2 micron con un apparato vuoto. Le celle possono poi essere lavati delicatamente dalla superficie del filtro con PBS, un altro tampone appropriato o medio prima di visualizzazione.
Far scorrere la preparazione
1. Preparare l'1% di agarosio con 1X Spizizens.
Aggiungere 5 ml di 10X magazzino Spizizens a 45 ml ddH2O con 0,5 g di agarosio, e forno a microonde a sciogliersi. Agarosio fuso a caldo è difficile da pipetta, e solidificato agarosio non entrerà la punta della pipetta. L'agarosio devono essere equilibrati in un bagno d'acqua ad una temperatura di circa 55-65 ° C, per entrare la punta della pipetta senza solidificazione all'interno del punta.
2. Disegna 20 l di Spizizens con 1% di agarosio fuso nella punta della pipetta. Pipetta una goccia (circa 1-2 mL) della soluzione di agarosio in ogni pozzetto (usiamo pure 15-diapositive, vedi Tabella 2) per formare superficiale pastiglie agarosio. L'agarosio si solidificano immediatamente. Le diapositive devono essere fatte immediatamente prima dell'applicazione delle cellule. Se le pastiglie di agarosio vengono lasciati a temperatura ambiente da soli, possono disidratarsi in pochi minuti e diventano inutilizzabili.
Pastiglie agarosio deve essere centrato e riempire ogni bene, ma hanno l'altezza minima per evitare di interrompere il coprioggetto, se le gocce sono troppo elevati (bubble-simili) o se il campione si estende al di là del confine bene, è sufficiente passare il bene pulire con un Kimwipe e applicare un agarosio nuovo pad.
3. Applicare l'intero campione di 300 microlitri (vedi punto 6) alla diapositiva, distribuiti in cima ad ogni pad agarosio. Questa quantità di cellule dovrebbe essere sufficiente a coprire ogni pozzetto nella diapositiva.
4. Lasciare il vetrino caricato con celle a temperatura ambiente (23 ° C) per circa dieci minuti. Questo passo consentirà alle cellule di stabilirsi sul pad agarosio diventando immobile e pronto per l'imaging. Per esigenze specifiche questa temperatura può avere bisogno di essere cambiato, per esempio, durante l'esecuzione di esperimenti che richiedono un cambiamento di temperatura 4.
5. Aspirare via del mezzo in eccesso da ogni pozzetto senza rimuovere le pastiglie stesse.
6. Applicare il coprioggetto alla diapositiva, premendo con decisione e in modo uniforme, ma delicatamente, tutta l'area della diapositiva. Verificare che la polizza di copertura è contro la diapositiva e che la polizza di copertura non viene sollevata sopra il vetrino.
Visualizzazione di cellule
1. Molti microscopi a fluorescenza diversi funzionerà bene. E 'fondamentale avere un 100X lente immersione in olio. Il laboratorio utilizza Simmons:
- Olympus BX61 microscopio dotato di 1,45 lente NA TIRFM olio obiettivo 100X ad immersione
- Hamamatsu ORCAR 2 telecamera CCD raffreddata
- Lumen 200 arco in metallo (Prima) fonte di luce.
- Per il rilevamento di GFP (CIC), filtro eccitazione ed emissione 460-500 510-560
- Per il rilevamento di FM4-64 (TRITC), filtro eccitazione ed emissione 510-560 572-648.
- Le immagini sono state catturate usando SlideBook 4,2 (Figura 1)
2. Portare le cellule a fuoco con luce bianca.
3. Catturare l'immagine con filtri appropriati per ciascun fluoroforo.
Rappresentante Risultati
Immagini rappresentative sono (Figura 1). GFP focolai devono essere ben definiti, mentre FM4-64 colorazione deve essere brillante e chiaro 4-7. Immagini GFP o membrana possono essere pseudo-colorato con qualsiasi colore, per consentire la massima qualità dell'immagine che sarà presentato senza perdere alcun dato.
Figura 1: le immagini GFP Rappresentante di B. subtilis proteine di fusione traslazionale. proteine GFP sono mostrati in verde, mentre FM4-64 membrana colorazione è mostrato in rosso. La barra di scala bianca indica 3 micron (A) muts-GFP [rilevanti genotipo: muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (gatto)]. In presenza di 600 mg / ml 2-aminopurine e 1 mM IPTG. FM4-64 segnale non viene presentato per mostrare più chiaramente le foci muts-GFP (B) MutL-GFP [rilevanti genotipo: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. In presenza di 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [rilevanti genotipo: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) Reca-GFP [rilevanti genotipo: recA:: recA-GFP (SPC)] in presenza di 20 ng / mL mitomicina C. (E) TagC-GFP [rilevanti genotipo: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] in presenza di 1 mg / mL mitomicina C.
| Trattamento / concentrazione o importo | Funzione | Tempo di incubazione |
| Mitomicina C (MMC) [20 e 150 ng / ml] | DNA agente alchilante | 1 ora |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] | mancata corrispondenza inducendo | 1 ora |
| Idrossiurea (HU) | esaurisce dNTP | 3 ore |
| luce ultravioletta (UV) 20 J/m2 | Timina-timina dimeri e 6-4 fotoprodotti | varia a seconda della fonte, di solito 20 secondi |
| grigi (radiazioni ionizzanti) da 5 a 100 Gy | Rompe doppio filamento, le interruzioni di singolo filamento e siti danno base | varia a seconda della fonte |
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Multitest scivolo, 15-oltre | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Microscopio copertura in vetro | Pescatore | 12-544-B | |
| Agarosio | Pescatore | BP160-500 | |
| Mitomicina C | Sigma | M0503-2MG | mutageno, indossare guanti |
| 2-Aminopurine | Sigma | A3509-250mg | guanti |
| Idrossiurea | Sigma | H8627-25G | guanti |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | sensibile alla luce |
Tabella 2. Lista dei reagenti e attrezzature specifiche:
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Discussion
Tentativi ed errori sono necessari per trovare condizioni di esposizione per immagini di altissima qualità per ogni ceppo, troviamo che 1 millisecondo è appropriato per le immagini a luce bianca, mentre l'esposizione da 100 a 2000 ms sono appropriati per GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) le immagini. Tempo di esposizione variano a seconda delle apparecchiature di imaging utilizzate. Si consiglia l'uso di un ceppo per 15 pozzetti vetrino da microscopio per il più semplice di imaging, come la qualità pad e la diffusione di cellule dal confine pad potrebbe complicare la differenziazione ceppo se ceppi più sono presenti sulla stessa diapositiva. La qualità dell'immagine dipende direttamente dalla qualità del pad agarosio in cui i batteri sono a riposo. Le immagini di altissima qualità sarà catturato da pastiglie agarosio dove i batteri sono fianco a fianco. Pastiglie che provocano le cellule batteriche al gruppo, impedendo un monostrato, produce immagini di qualità scadente. Pastiglie che sono troppo spesso produce un segnale alto sfondo fluorescente, mentre i rilievi che sono disidratati non consentirà alle cellule di riposare correttamente. Questi difetti pad agarosio di solito provoca la qualità dell'immagine molto povera. Se un bene produce immagini di qualità scadente, semplicemente passare al successivo bene. E 'ideale per catturare tra 50 e 200 cellule per immagine. Microscopia a fluorescenza ha fornito una grande quantità di informazioni dettagliate sugli spunti cellulari che direttamente l'assemblaggio di riparazione del DNA e delle proteine in replica focolai in vivo. Con la pratica, questa tecnica può essere applicata con successo ad una varietà di complessi proteici in molte specie batteriche.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Drs. Philina S. Lee e Alan D. Grossman per la formazione inizialmente LAS in microscopia a fluorescenza. Gli autori hanno anche ringraziare Drs. Melanie Berkmen e Hajime Kobayashi aiuto e suggerimenti per l'imaging. Questo lavoro è stato supportato da start-up fondi del Collegio di Letteratura, Scienze e Arti e dal Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo presso l'Università del Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
