Summary
Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen in
Abstract
Zowel de prokaryoten en eukaryoten te reageren op DNA-schade door een complex geheel van lichamelijke veranderingen. Veranderingen in genexpressie, de herverdeling van bestaande eiwitten, en de assemblage van nieuwe eiwit-complexen kan worden gestimuleerd door een verscheidenheid van DNA-laesies en verkeerde DNA basenparen. Fluorescentie microscopie is gebruikt als een krachtig experimenteel hulpmiddel voor het visualiseren en te kwantificeren deze en andere reacties op DNA laesies en DNA-replicatie-status te controleren binnen het complex subcellulaire architectuur van een levende cel. Translationele fusies tussen fluorescerende reporter eiwitten en componenten van de DNA-replicatie en reparatie machines zijn gebruikt om de signalen te bepalen die zich richten op DNA-reparatie eiwitten aan hun verwante letsels
Protocol
Groeiende culturen van cellen voor microscopie
1. Een of twee dagen voor de beeldvorming, de voorbereiding van de B. subtilis stam die het translationele fusie-eiwit u wenst te visualiseren. Trial rondes van de stappen 1A en 1B zal nodig zijn om te bepalen welke groei de conditie van de beste beelden van je stam biedt. In de meeste gevallen, moeten cellen worden afgebeeld tijdens de exponentiële groei fase.
- Voor sommige B. subtilis stammen (in het bijzonder, stammen die slecht groeien als gevolg van de integratie van de translationele fusie tussen het gen van belang en GFP op de endogene locus), de initiële groei voor twee dagen voorafgaand aan de beeldvorming is nodig voor hoge kwaliteit beelden. Op de eerste dag, streep de B. subtilis stam af te beelden op LB-agar met selectieve antibiotica (s) en incubeer overnacht bij 30 ° C. Op de tweede dag, enten 100 pi van 0,85% zoutoplossing met een enkele kolonie en het uitvoeren van drie 10-voudige seriële verdunningen op LB agar platen (met selectieve antibiotica), plating 100 ul van elke verdunning, gevolgd door een incubatie overnacht bij 30 ° C. Op de derde dag, selecteert u de verdunning plaat met licht confluente groei van cellen. Licht confluerende groei op een plaat zal de groei medium met een gezonde, exponentieel groeiende starter inoculum aan potentieel rendement uitstekende imaging resultaten (zie stap 4). Deze stap is vooral nuttig voor de hoogste kwaliteit membraan beeldvorming met de vlek FM4-64.
- Andere B. subtilis stammen kunnen gewoon worden toegepast op selectieve LB-agar medium voor enkele kolonies met een steriele stok de dag voorafgaand aan de beeldvorming en incubeer overnacht bij 30 ° C. De volgende dag, zal cellen op deze plaat voldoende zijn om te gebruiken als een inoculum voor de beeldvorming (zie stap 4).
OPMERKING: B. subtilis, 's nachts culturen in vloeibaar medium niet geschikt zijn te wijten aan een combinatie van spore vorming en quorum reacties, die een langere periode van de aanlooptijd de groei 1 zal veroorzaken.
2. Op de ochtend van beeldvorming, plaats 10 ml van de S7 50 1-3 medium in een 125 ml steriele erlenmeyer.
3. Resuspendeer de cellen in maximaal 2 ml van S7 50 medium van de LB agar plaat met enkele kolonies of het licht samenvloeiende cellen een inoculum te verkrijgen.
4. Voeg genoeg S7 50 medium-cel inoculum aan de erlenmeyer met 10 mL S7 50 medium voor een cultuur met een eerste optische dichtheid gemeten bij 600 nm (OD 600) van ~ 0,08 tot 0,1. Bij deze stap is het belangrijk om minstens een 10-voudige lucht medium verhouding. Zo maken we gebruik van 10 tot 12,5 ml geënt medium in een 125 ml erlenmeyer.
5. Grow elke cultuur bij 30 ° C tot de cultuur in een OD 600 ~ 0.5-0.8. Schudden water baden hebben de voorkeur met de omwentelingen per minuut 150 tot 200. Culturen uitgedaagd met DNA te beschadigen of te mismatch inducerende middelen dienen te worden in een vroeg exponentiële groeifase OD 600 zodanig dat de cellen zal het doel te bereiken OD 600 met de extra periode van groei die nodig is voor de behandeling (zie tabel 1)
Bijvoorbeeld 2-aminopurine moet een uur van de behandeling, en dus een cultuur die werden behandeld met 2-aminopurine moet op OD 600 ~ 0.3-0.4, zodanig dat het een uur van de behandeling / groei resulteert in een OD 600 ~ 0.5-0.8, waarbij de cellen zijn klaar voor de beeldvorming.
Monstervoorbereiding
1. Pipetteer 300 ul van gekweekte cellen in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Als beeldvorming van cellulaire membranen gewenst is, voeg 1:1000 verdunning van FM4-64 membraan vlek (Invitrogen) toe aan elk monster van een 1 mg / ml stamoplossing. Een titratie van FM4-64 kan nodig zijn om de gewenste fluorescentie-signaal te bereiken. Een typische titratie bereik is 1:100, 1:1000 en 1:10.000.
3. Laat de monsters op kamertemperatuur komen voor het tot tien minuten of wanneer de schuif wordt bereid met 1% agarose in 1X Spizizens medium zoals hieronder beschreven (stap 1 van "prepareren" te zien).
4. Als de concentratie van cellen nodig is, geven wij de voorkeur filtering cellen met behulp van een 0,2 um filter met een stofzuiger apparaat. Cellen kunnen vervolgens voorzichtig worden gewassen van het oppervlak van de filter met PBS, een ander geschikt medium buffer of voorafgaand aan de visualisatie.
Slide Voorbereiding
1. Bereid 1% agarose met 1X Spizizens.
Voeg 5 ml van 10X Spizizens voorraad 45 ml ddH2O samen met 0,5 g agarose, en een magnetron te smelten. Warme gesmolten agarose is moeilijk te pipet, en gestolde agarose zal niet de pipetpunt in te voeren. De agarose moet evenwicht zijn in een waterbad tot een temperatuur van ~ 55 tot 65 ° C voor het aan de pipetpunt betreden zonder stollen in de tip.
2. Teken 20 pl van Spizizens met 1% gesmolten agarose in de pipetpunt. Pipetteer een enkele druppel (ongeveer 1-2 pi) van de agarose oplossing in elke dia goed (we gebruiken 15-slides goed, zie tabel 2) te ondiep agarose pads vormen. De agarose zal onmiddellijk stollen. Dia's moeten eveneens onmiddellijk voorafgaand aan de toepassing van de cellen. Als de agarose pads zijn bij kamertemperatuur alleen, kunnen ze uitdrogen binnen enkele minuten en onbruikbaar geworden.
Agarose pads moet in het midden en vul elk goed, maar hebben minimale hoogte te voorkomen dat het dekglaasje, als druppels zijn te hoog (bubble-achtige) of als het monster verspreidt zich voorbij de grens goed, gewoon vegen het goed schoon met een Kimwipe en breng een nieuwe agarose pad.
3. Breng de gehele 300 ul monster (zie stap 6) aan de dia, verdeeld over de top van elke agarose pad. Dit bedrag van de cellen moet voldoende zijn om elk putje deksel op de dia.
4. Laat de schuif vol met cellen te zitten bij kamertemperatuur (23 ° C) gedurende ongeveer tien minuten. Deze stap zal zorgen voor de cellen om zich te vestigen op de agarose pad steeds immobiel en klaar voor imaging. Voor gespecialiseerde heeft deze temperatuur kan veranderd moeten worden, bijvoorbeeld bij het uitvoeren van experimenten die een temperatuur verschuiving vier vereisen.
5. Aspireren weg de overtollige medium uit elk putje, zonder het verwijderen van de pads zelf.
6. Breng de dekglaasje aan de dia en druk stevig en gelijkmatig, maar voorzichtig, over het gebied van de dia. Controleer of dat de dekglas is tegen de glijbaan en dat het deksel slip is niet verheven boven de dia.
Visualisatie van cellen
1. Veel verschillende fluorescentie microscopen goed zal werken. Het is van cruciaal belang om een 100X olie-immersie lens te hebben. De Simmons Lab gebruikt:
- Olympus BX61 microscoop uitgerust met een 1,45 NA TIRFM 100X olie-immersie objectief
- Hamamatsu ORCAR twee CCD-camera gekoelde
- Lumen 200 arc metaal (Prior) lichtbron.
- Voor het opsporen van GFP (FITC), filter excitatie en emissie 460-500 510-560
- Voor de detectie van FM4-64 (TRITC), filter excitatie en emissie 510-560 572-648.
- Beelden werden vastgelegd met behulp van SlideBook 4.2 (figuur 1)
2. Breng de cellen in focus met behulp van wit licht.
3. Leg het beeld met passende filters voor elke fluorofoor.
Representatieve resultaten
Representatieve afbeeldingen worden weergegeven (figuur 1). GFP haarden moet goed gedefinieerd, terwijl de FM4-64 kleuring moeten helder en duidelijk 4-7. GFP of membraan beelden kunnen pseudo-gekleurd worden met alle kleuren, zodat voor de hoogste kwaliteit beeld worden gepresenteerd zonder gegevens te verliezen.
Figuur 1: Vertegenwoordiger GFP beelden van B. subtilis translationele fusie-eiwitten. GFP eiwitten zijn in het groen, terwijl de FM4-64 membraankleuring wordt getoond in het rood. De witte schaal balk geeft drie micrometer (A) MutS-GFP [relevante genotype: muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (cat)]. In de aanwezigheid van 600 ug / ml 2-aminopurine en 1 mM IPTG. FM4-64 signaal wordt niet weergegeven in om meer duidelijk de MutS-GFP brandpunten (B) MutL-GFP [relevante genotype: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. In aanwezigheid van 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [relevante genotype: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevante genotype: recA:: recA-GFP (SPC)] in het bijzijn van 20 ng / mL mitomycine C. (E) TagC-GFP [relevante genotype: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] in de aanwezigheid van 1 ug / ml mitomycin C.
| Behandeling / concentratie of hoeveelheid | Functie | De tijd van incubatie |
| Mitomycine C (MMC) [20 tot 150 ng / ml] | DNA alkylerende stof | 1 uur |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 ug / ml] | mismatch inducerende | 1 uur |
| Hydroxyurea (HU) | put dNTPs | 3 uur |
| ultraviolet licht (UV) 20 J/m2 | Thymine-dimeren thymine en 6-4 fotoproducten | varieert afhankelijk van de bron, meestal 20 seconden |
| grijzen (ioniserende straling) 5-100 Gy | Dubbelstrengs breuken, enkele streng breuken en de basis schade websites | varieert afhankelijk van de bron |
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar (optioneel) |
| Multitest glijbaan, 15-well | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Microscoop Dekglas | Visser | 12-544-B | |
| Agarose | Visser | BP160-500 | |
| Mitomycine C | Sigma | M0503-2MG | mutageen, handschoenen |
| 2-aminopurine | Sigma | A3509-250mg | handschoenen |
| Hydroxyurea | Sigma | H8627-25G | handschoenen |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | lichtgevoelige |
Tabel 2. Lijst van specifieke reagentia en apparatuur:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trial and error zijn verplicht om de blootstelling voorwaarden te vinden voor de hoogste kwaliteit beelden voor elke stam, vinden we dat een milliseconde is geschikt voor wit licht beelden, terwijl de blootstelling van 100 tot 2000 ms zijn geschikt voor GFP (FITC) en FM4-64 (TRITC ) beelden. Belichtingstijd is afhankelijk van de gebruikte beeldvormende apparatuur. Wij raden het gebruik van een stam per 15-well microscoop glijbaan voor de eenvoudigste beeldvorming, als pad de kwaliteit en de verspreiding van cellen van het pad grens kon stam differentiatie ingewikkelder als er meerdere stammen aanwezig zijn op dezelfde dia. De beeldkwaliteit is rechtstreeks afhankelijk van de kwaliteit van de agarose pad waar de bacteriën te rusten. De hoogste kwaliteit foto's worden opgevangen uit agarose pads waar bacteriën worden naast elkaar. Pads die de bacteriële cellen te klonteren veroorzaken, het voorkomen van een monolaag, zal produceren slechte beelden. Pads die te dik zal produceren een hoge achtergrond fluorescent signaal, terwijl de pads die zijn uitgedroogd zal niet toestaan dat voor de cellen om goed te rusten. Deze agarose pad gebreken zal meestal resulteren in zeer slechte beeldkwaliteit. Als er een goed is het produceren van een slechte foto's, simpelweg door naar het volgende goed. Het is ideaal om tussen de 50 en 200 cellen per beeld vast te leggen. Fluorescentie microscopie heeft een schat aan informatie waarin de cellulaire signalen die de aanmaak van DNA-reparatie en-replicatie eiwitten in brandpunten in vivo direct. Met de praktijk, kan deze techniek met succes worden toegepast op een verscheidenheid van eiwitcomplexen in vele soorten bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen Drs bedanken. Philina S. Lee en Alan D. Grossman voor de eerste training LAS in fluorescentie microscopie. De auteurs danken ook Drs. Melanie Berkmen en Hajime Kobayashi voor hulp en tips voor beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door start-up middelen van de College of Literature, Science & Kunst en van de afdeling Moleculaire, Cellular, en Ontwikkelingsbiologie aan de Universiteit van Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
