Summary
Ett detaljerat protokoll beskrivs för bildhantering i realtid bildning av DNA-reparation i
Abstract
Både prokaryoter och eukaryoter svara på DNA-skador genom en komplex uppsättning av fysiologiska förändringar. Förändringar i genuttryck, omfördelning av befintliga proteiner och montering av nya proteinkomplex kan stimuleras av olika DNA-skador och missmatchad DNA par bas. Fluorescensmikroskopi har använts som ett kraftfullt experimentell verktyg för att visualisera och kvantifiera dessa och andra svar på DNA-skador och även övervaka status DNA-replikation inom den komplexa subcellulära arkitekturen i en levande cell. Translationell fusioner mellan fluorescerande reporter proteiner och delar av DNA-replikation och reparation maskiner har använts för att bestämma ledtrådar som mål-DNA reparation proteiner till deras likartade lesioner
Protocol
Växande cellkulturer för mikroskopi
1. En eller två dagar före bildhantering, förbereda B. subtilis stam innehåller translationell fusionsproteinet du vill visualisera. Trial rundor av steg 1A och 1B kommer att bli nödvändigt att avgöra vilken tillväxt tillstånd ger de bästa bilderna på din stam. I de flesta fall bör celler avbildas under exponentiell tillväxtfas.
- För vissa B. subtilis stammar (i synnerhet stammar som växer dåligt på grund av integrationen av translationell fusion mellan genen av intresse och GFP på dess endogena lokus), inledande tillväxten för två dagar före imaging är nödvändigt för högkvalitativa bilder. Den första dagen, stryk B. subtilis stam som ska avbildas på LB-agar med selektiv antibiotikum (s) och inkubera över natten vid 30 ° C. Den andra dagen, inokulera 100 ìl 0,85% saltlösning med en enda koloni och utföra tre 10-faldigt seriespädningar på tallrikar LB agar (med selektiv antibiotika), plätering 100 mikroliter av varje spädning, följt av inkubering över natten vid 30 ° C. På den tredje dagen, välj utspädning plattan med ljus sammanhängande tillväxt av celler. Ljus sammanhängande tillväxt på en tallrik kommer att ge tillväxt medium med en frisk, exponentiellt växande förrätt inokulat till potentiellt ge utmärkt bildbehandling resultat (se steg 4). Detta steg är särskilt användbart för högsta kvalitet membran avbildning med fläcken FM4-64.
- Andra B. subtilis stammar kan bara appliceras på selektivt LB agar medium för enstaka kolonier med en steril pinne dagen före bildbehandling och inkubera över natten vid 30 ° C. Följande dag kommer cellerna på denna platta vara tillräckligt att använda som ett inokulat för avbildning (se steg 4).
OBS: För B. subtilis, övernattning kulturer i flytande medium inte är lämpliga på grund av en kombination av spor bildas och svar beslutsmässighet, vilket kommer att orsaka en lång period av eftersläpning fas tillväxt 1.
2. På morgonen imaging Häll 10 ml av S7 50 1-3 mellanstora till en 125 ml steril Erlenmeyerkolv.
3. Resuspendera cellerna i upp till 2 mL S7 50 medium från LB agarplatta med enstaka kolonier eller ljuset konfluenta cellerna för att få ett inokulat.
4. Lägg tillräckligt S7 50 medellång cell inokulat till Erlenmeyerkolven med 10 ml S7 50 medium för en kultur med en initial optisk densitet mäts vid 600 nm (OD 600) på ~ 0,08 till 0,1. I detta steg är det viktigt att ha minst en 10-faldig luft till medelstora förhållande. Därför använder vi 10 till 12,5 ml inokuleras medium i en 125 ml E-kolv.
5. Odla varje kultur vid 30 ° C tills den kultur når en OD 600 ~ 0,5-0,8. Shaking vattenbad är att föredra med varv per minut 150 till 200. Kulturer utmanas med DNA-skada eller obalans inducerande medel bör på ett tidigt exponentiell tillväxtfas OD 600 så att cellerna kommer att nå målet OD 600 med ytterligare en period av tillväxt som krävs för behandling (se tabell 1)
Till exempel kräver 2-aminopurine en timmes behandling och därför en kultur som behandlats med 2-aminopurine bör vara OD 600 ~ 0,3-0,4, så att en timmes behandling / resultat tillväxt i en OD 600 ~ 0,5-0,8, där cellerna är redo för avbildning.
Provberedning
1. Pipettera 300 l av odlade celler i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
2. Om avbildning av cellmembran önskas, tillsätt 1:1000 utspädning av FM4-64 membran fläck (Invitrogen) till varje prov från en 1 mg / ml stamlösning. En titrering av FM4-64 kan krävas för att uppnå önskad fluorescenssignalen. En typisk titrering serien är 1:100, 1:1000 och 1:10,000.
3. Låt prover för att sitta vid rumstemperatur i upp till tio minuter eller när bilden håller på att utarbetas med 1% agaros i 1X Spizizens medium som beskrivs nedan (se steg 1 i "preparatet").
4. Om koncentrationen av celler krävs, föredrar vi filtrering celler med en 0,2 ìm filter med ett vakuum apparat. Celler kan sedan tvättas varsamt från ytan av filtret med PBS, en annan lämplig buffert eller medelstora före visualisering.
Preparatet
1. Bered 1% agaros med 1X Spizizens.
Tillsätt 5 ml 10X Spizizens lager till 45 ml ddH2O tillsammans med 0,5 g agaros, och mikrovågsugn för att smälta. Hot smälta agarosen är svårt att pipett och stelnat agaros inte kommer in i pipettspetsen. Den agarosen ska vara utjämnat i vattenbad till en temperatur på ~ 55-65 ° C för att komma in i pipettspetsen utan stelnar inom spets.
2. Rita 20 ìl Spizizens med 1% smält agaros i pipettspetsen. Pipettera en droppe (ca 1-2 mikroliter) av agaroslösningen i varje bild också (vi använder 15-bra bilder, se tabell 2) för att bilda grunda agaros trampdynor. Agar stelnar omedelbart. Diabilder måste också göras omedelbart före tillämpningen av celler. Om agarosen kuddar finns kvar i rumstemperatur ensam, kan de torkar inom några minuter och bli oanvändbar.
Agarosen kuddar ska centreras och fyll varje brunn, men har minsta höjd för att undvika att störa täckglas, om dropparna är för höga (bubble-liknande) eller om provet sprider sig utanför de väl gränsen, helt enkelt dra de väl rent med en Kimwipe och tillämpa en nya agaros pad.
3. Applicera på hela 300 l prov (se steg 6) till bilden, fördelat på toppen av varje agaros pad. Denna mängd celler bör vara tillräckligt för att täcka varje brunn på bilden.
4. Låt bilden laddad med celler för att sitta vid rumstemperatur (23 ° C) i cirka tio minuter. Detta steg kommer att möjliggöra för cellerna att bosätta sig på agarosen plattan blir orörliga och redo för bildbehandling. För specialbehov denna temperatur kan behöva ändras, till exempel när de utför experiment som kräver en temperatur skift 4.
5. Sug bort överflödigt medel från varje brunn utan att ta bort kuddar själva.
6. Applicera täckglas i bilden, tryck fast och jämnt, men försiktigt, över det område av bilden. Kontrollera att se till att locket glida är emot bilden och att locket glider inte upp ovanför bilden.
Visualisering av celler
1. Många olika fluorescens mikroskop kommer att fungera bra. Det är viktigt att ha en 100X objektiv oljeimmersion. Den Simmons Lab använder:
- Olympus BX61 mikroskop utrustat med 1,45 NA TIRFM 100X oljeimmersion objektiv
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD svalnat kamera
- Lumen 200 båge metall (Före) ljuskälla.
- För detektion av GFP (FITC), filter excitation 460-500 och utsläpp 510-560
- För detektion av FM4-64 (TRITC), filter excitation 510-560 och utsläpp 572-648.
- Bilderna har tagits med SlideBook 4,2 (figur 1)
2. Ta cellerna i fokus med vitt ljus.
3. Fånga bilden med hjälp av lämpliga filter för varje fluoroforen.
Representativa resultat
Representativa bilder visas (Figur 1). GFP fokus bör vara väl definierat, medan FM4-64 färgning bör vara ljusa och klara 4-7. GFP eller membran bilder kan pseudo-färgade med valfri färg, för att möjliggöra högsta kvalitet bild som ska presenteras utan att förlora några data.
Figur 1: Representant GFP bilder av B. subtilis translationell fusionsproteiner. GFP proteiner visas i grönt, medan FM4-64 membranfärgning visas i rött. Den vita skalan stapeln visar 3 mikrometer (A) Muts-GFP [relevanta genotyp: Muts - GFP (SPC), amyE:: Pspac mutL (katt)]. I närvaro av 600 mikrogram / ml 2-aminopurine och 1 mm IPTG. FM4-64 signalen inte fram för att tydligare visa Muts-GFP foci (B) MutL-GFP [relevanta genotyp: mutL:: mutL-GFP (SPC)].. I närvaro av 2-aminopurine (C) DnaX-GFP [relevanta genotyp: dnaX:: dnaX-GFP (SPC)]. (D) RecA-GFP [relevanta genotyp: recA:: recA-GFP (SPC)] i närvaro av 20 ng / ml mitomycin C. (E) TagC-GFP [relevanta genotyp: tagC:: tagC-GFP (SPC) ] i närvaro av 1 mikrogram / ml mitomycin C.
| Behandling / koncentration eller mängd | Funktion | Tid för inkubation |
| Mitomycin C (MMC) [20 till 150 ng / ml] | DNA alkylerande medel | 1 timme |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 mikrogram / ml] | mismatch förmå | 1 timme |
| Hydroxyurea (HU) | tär dNTPs | 3 timmar |
| ultraviolett ljus (UV) 20 J/m2 | Tymin-tymin dimers och 6-4 fotoprodukter | varierar beroende på källa, vanligtvis 20 sekunder |
| gråskalor (joniserande strålning) från 5 till 100 Gy | Dubbel strängbrott, enstaka pauser Strand och bas webbplatser skador | varierar beroende på källan |
| Reagensets namn | Företag | Katalognummer | Kommentarer (frivilligt) |
| Multitest bild 15-samt | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Mikroskop skyddsglas | Fisher | 12-544-B | |
| Agarosen | Fisher | BP160-500 | |
| Mitomycin C | Sigma | M0503-2mg | mutagent, handskar |
| 2-Aminopurine | Sigma | A3509-250mg | handskar |
| Hydroxyurea | Sigma | H8627-25G | handskar |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | ljuskänsliga |
Tabell 2. Förteckning över specifika reagenser och utrustning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trial and error är skyldiga att hitta exponeringsförhållanden för bilder med högsta kvalitet för varje stam, finner vi att en millisekund är lämpligt för vitt ljus bilder, medan exponering på 100 till 2000 ms är lämpliga för GFP (FITC) och FM4-64 (TRITC ) bilder. Exponeringstiden varierar beroende på vilken utrustning för bildåtergivning. Vi rekommenderar användning av en stam per 15-och objektglas för den enklaste bildhantering, som pad kvalitet och spridning av celler från plattan gränsen kan komplicera stam differentiering om flera stammar finns på samma bild. Bildkvaliteten är direkt beroende av kvaliteten på agarosen pad där bakterierna vilar. Bilder med högsta kvalitet kommer att fångas in från agaros kuddar där bakterier finns sida vid sida. Pads som orsakar bakteriecellerna att klumpa, förebygga ett monolager, kommer att producera dåliga bilder. Kuddar som är för tjocka kommer att producera en hög bakgrund fluorescerande signal, medan kuddar som är uttorkade inte tillåter för att cellerna ska vila ordentligt. Dessa agarosen pad fel kommer oftast resultera i mycket dålig bildkvalitet. Om en brunn producerar dåliga bilder, helt enkelt gå vidare till nästa brunn. Den är idealisk för att fånga mellan 50 och 200 celler per bild. Fluorescensmikroskopi har gett en mängd information med uppgifter om cellulära signaler som styr sammansättningen av DNA-reparation och proteiner replikering till högborgar in vivo. Med lite övning kan denna teknik framgångsrikt användas till en mängd olika proteinkomplex i många bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Philina S. Lee och Alan D. Grossman för initialt utbildning LAS i fluorescensmikroskopi. Författarna vill också tacka Dr. Melanie Berkmen och Hajime Kobayashi för hjälp och tips för bildbehandling. Detta arbete stöddes av uppstart medel från högskolan av litteratur, vetenskap och konst och från Institutionen för molekylär, cellulär och utvecklingsbiologi vid University of Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
