Använda optokinetic svar att studera visuell funktion zebrafisk

Summary

Optokinetic svar har i stor utsträckning använts för att bedöma den visuella funktioner larver zebrafisk. Icke desto mindre är standardprotokoll för larver fisk som ännu inte kan tillämpas direkt hos vuxna

Abstract

Optokinetic svar (okr) är ett beteende som ett djur vibrerar ögonen följa en roterande galler runt den. Det har i stor utsträckning använts för att bedöma den visuella funktioner larver zebrafisk ^1-5. Icke desto mindre är standardprotokoll för larver fisk som ännu inte kan tillämpas direkt i vuxen zabrafish. Här presenterar vi hur man mäter okr av vuxna zebrafisk med vår enkla specialbyggda apparater som arbetar med ett nytt protokoll som är etablerad i vårt laboratorium. Både våra apparater och steg-för-steg förfarande med okr vuxna zebrafisk illustreras i denna video. Dessutom är de mätningar av larver okr, liksom optomotor svar (OMR) test av vuxna zebrafisk, också visat i den här videon. Denna okr analys av vuxna zebrafisk i våra experiment får pågå i upp till fyra timmar. Sådana okr test som används i vuxen fisk kommer att dra till synfunktion utredningen mer effektivt när de vuxna fiskarna visionen är manipulerad.

Su-Qi Zou och Wu Yin bidragit lika för detta dokument.

Protocol

Del I: Konstruera okr apparaten

Detaljer visas i video demonstration.

Del II: okr av Adult Zebrafish

Om din lab har konstruerat en okr apparat, är det viktigaste av vuxna zebrafisk okr att hålla fisken. I denna del kommer vi att visa dig steg för steg.

Våra apparater komponerar följande delar liknar nämns andra. Den cirkulära fisk kammaren är 7,0 cm i ytterdiameter, 6,5 cm i innerdiameter och 7,0 cm i hög. Trumman runt fisken kammaren är 8,5 cm i ut diameter, 7,5 cm i innerdiameter och 7,0 cm i hög. Det kan rotera medurs och moturs med hastighet från 20 ~ 70 varv per minut (rpm). Elva cykler av svarta och vita ränder är ritade på ett ritpapper som levt på utsidan av trumman. Ljuset systemet består av två tuber cirkel ljus 21 cm diameter.

Figur 1. Den modell av svampen. Klippan som gjorts i detta mitten är att se till att synfältet inte är skyddad.

1. En svamp som visas i figur 1 består av två delar. Den vänstra delen är längd 3 cm x bredd 3 cm x Hög 2 cm. Den högra delen är längd 3 cm x bredd 3 cm x hög 3 cm.
2. Sätt denna svamp i botten av fisk kammare och häll uppfödning vatten i ca 2 cm djup. Luftbubbla som gömmer sig i svampen ska drivas ut.
3. Sätt in ett stift i framsidan av högra delen av svamp, ca 2 mm bakom klippan.
4. Bedöva en vuxen zebrafisk i MS-222.
5. Sätt zebrafisk på svampen med rygg upp och låta den ena sidan av dess bröstfenan före den första pinnen.
6. Den andra stift sätts bakom den andra bröstfenan. Det skulle kunna undvika zebrafisk krymper kroppen genom att samarbeta med den första PIN-kod (se också i bild. 2).
7. Klämma svansen med en artär klämma och fixa artären klämman i en bit gummi (modellera) som anslöt sig till den fisk kammaren.
8. Den tredje och fjärde stiftet är planterad på platsen nära svabbprover por i fisk kropp. Det kan förhindra zebrafisk att vifta sin svans intensivt.
9. Den femte stift är placerad mellan den första och den tredje stiftet och sedan det sjätte stiftet är på andra sidan av det. De kunde hindra zebrafisk från skaka sin kropp.
10. Den sjunde och åttonde stift sätts in i områden nära gäl att hålla huvudet läggning.
11. Häll uppfödning vatten i fisken kammaren.
12. Efter zebrafisk vaknar, låt den anpassa sig i 5 ~ 10 minuter.
13. Slå på ljuset av denna apparat och låt zebrafisk anpassa denna belysning i 2 minuter.
14. Slå på motorn för att driva gallret och låt zebrafisk att anpassa sig i 1 minut.
15. Slå på kameran och registrera förflyttning av ögonen.
16. Analysera ögat vinklar ⁶ och siffror saccade på din dator (Ett representativt exempel i ögat vinklar analysen visas i Fig. 2).

Figur 2. Vinkeln mellan ögat axeln och kroppens axel.

a) När den riktning galler är nasal-to-temporal, definierade vi vinkeln i före fisken kropp är en negativ vinkel och vinkeln på fisken kroppen är en positiv vinkel, tvärtom (för kort genomgång också se Ref. 6). Siffror i denna siffra representerar sekvens av stiften.

b) okr analys exempel från en fisk i vanlig grupp. En en-sekunders film över till en serie bilder och ögat vinklar i varje bildruta mättes med Image-Pro Plus programvara. Varje punkt i figuren representerar varje bildruta vi mätte.

Anmärkningar:

1. Alla stift bara används för att förhindra zebrafisk skakar sin kropp, för hårt är skadligt för fisk.
2. Artery klämma kan skada svansen som sin kontaktyta är liten. När svansen är gratis, är det mycket svårt att fixa detta fisk. Wrap ett bandage runt svansen rekommenderas i vissa tillstånd.
3. Den sjunde och åttonde stift som är planterade i området nära Gill bör inte skydd från sin syn på galler.

Del III. Okr av Larvernas Zebrafish

1. Metylcellulosa

Larver zebrafisk kan vara fixerad i 6% metylcellulosa lösning samtidigt hålla vid liv under lång tid. Förbered metylcellulosa lösning enligt följande.

1. Koka 200 ml DDH ₂ O i mikrovågsugn ca 3 minuter på hög nivå.
2. Överför varmvatten till en omrörning kokplatta och rör om kraftigt.
3. Tillsätt 12 g metylcellulosa i det varma vattnet gradvis.
4. Håll omrörning i 3 minuter efter metylcellulosa är väl spridda.
5. Kyl lösningar med isvatten tills det blir klart, och sedan placera den i 4 ° C.

1. Par två manliga och en kvinnlig vuxna zebrafisk i en parning tank vid 17:00 efter utfodring. Nästa morgon överföra dem till en ny parning tank och samla in embryon efter 1 timme.
2. Äggen hålls i embryo medium i ett 28,5 ± 0,5 ° C inkubator med ljuset: mörka cykel 14:10.
3. Ägg kommer att kläckas ut i 48 timmar efter befruktning (HPF) och okr kommer att testas vid 72 HPF eller senare. I denna video, yngel är på 5 DPF.

3. Förfarande för okr

1. Placera apparaten under stereoskopet utrustad med CCD-kamera och slå på ljuset av denna apparat.
2. Tillsätt 20 ml 6% methycellulose i en 55-mm petriskål.
3. Placera flera yngel i rad i mitten av denna maträtt.
4. Sätt en luftbubbla om en volym på 1 l i kameran området, kan det vara som en spegel att reflektera riktning gallret.
5. Slå på motorn och spela in rörelsen i sina ögon.

Del IV. OMR av vuxna Zebrafish

Vuxen zebrafisk OMR även kunde utföras med denna apparat, bara placera en kolumn i fisken kammaren för att förhindra fiskar simma över centrum (visade i Fig.3a, roterande hastighet är 36 rpm, svart-vit cykler är 11).

1. Lägg en fisk i den här fisken kammare.
2. Stå en kolumn med 2 cm diameter i mitten av den här fisken kammare.
3. Anpassa för en minut både i stilla galler och rotation galler.
4. Rekord rörelse zebrafisk.
5. Analysera tillfällighet andelen tid på din dator (ett exempel visas i Fig.3b, roterar hastighet 36 rpm, är svart-vit cykel 11)

Figur 3. OMR av Adult zebrafisk. (A) En vit plast kolonn var placerad i centrum av fisk kammare för att hindra fiskar simma över den. (B) sammanfaller andelen vuxna zebrafisk efter gallret. Den tillfällighet svarsfrekvens definierades som den andel av följande gallret tid att den totala inspelningstiden. Värdet på 50% tyder på att fisken simmar slumpmässigt, medan 100% anger gallret fiskar efter mycket bra. Båda synnerverna krossades med smycken pincett ca 10 sekunder. Beteendet hos OMR framstod som en slumpmässig simma efter krossa.

Discussion

Enligt definitionen av okr, det är ett fenomen som djuren flytta sina ögon för att föra en roterande galler spontant. Om detta beteende har bedrivits under lång tid (t.ex. över 6 timmar), kan ögats muskler vara trött och okr kommer att dämpas.

Vuxen zebrafisk OMR har beskrivits helt av andra ^7. I denna video visar vi bara du detta beteende med våra apparater. När synnerverna krossas, de kunde inte följa detta galler mycket väl.

Vi har utfört okr provning av uppförande hos vuxna, larver zebrafisk och OMR hos vuxna med vår enkla skräddarsydda apparat för att bedöma den visuella funktion zebrafisk. Denna okr analys av vuxna zebrafisk i våra experiment kunde hålla tillräckligt stark inom en period på 4 timmar utan att skada den. Detta kan öppna upp okr test i vuxen fisk studie på mer effektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP