En utilisant la réponse optocinétique pour étudier la fonction visuelle du poisson zèbre

Summary

La réponse optocinétique a été largement utilisé pour évaluer les fonctions visuelles du poisson zèbre larvaire. Néanmoins, le protocole standard pour les larves de poissons ne sont pas encore facilement applicables chez les adultes

Abstract

La réponse optocinétique (OKR) est un comportement que l'animal vibre ses yeux de suivre une grille tournante autour d'elle. Il a été largement utilisé pour évaluer les fonctions visuelles des larves de poisson zèbre ^1-5. Néanmoins, le protocole standard pour les larves de poissons ne sont pas encore facilement applicables dans zabrafish adulte. Ici, nous introduisons la façon de mesurer l'OKR du poisson zèbre adulte avec nos personnalisé simple construit un appareil utilisant un nouveau protocole qui est établi dans notre laboratoire. Tant notre appareil et l'étape par étape la procédure d'OKR chez le poisson zèbre adulte sont illustrées dans cette vidéo. En outre, les mesures de l'OKR larvaire, ainsi que la réponse optomoteur (OMR) test de poisson zèbre adulte, il est aussi démontré dans cette vidéo. Ce test OKR du poisson zèbre adulte dans notre expérience peut durer jusqu'à 4 heures. Ces tests OKR appliquée dans les poissons adultes bénéficieront d'une enquête de la fonction visuelle plus efficace lorsque le système de vision adulte de poisson est manipulé.

Su-Zou et Qi Wu Yin ont contribué également à ce document.

Protocol

Partie I: Construire l'appareil OKR

Détails sont montrés dans la vidéo de démonstration.

Partie II: OKR des adultes Zebrafish

Si votre laboratoire a construit un appareil OKR, la clé de l'adulte poisson zèbre OKR est de tenir le poisson. Dans cette partie, nous allons vous montrer étape par étape.

Notre appareil compose des pièces suivantes semblable à d'autres cités. La chambre de poissons circulaire est 7,0 cm de diamètre extérieur, 6,5 cm de diamètre intérieur et 7,0 cm de haut. Le tambour autour de la chambre de poisson est de 8,5 cm de diamètre sur 7,5 cm de diamètre intérieur et 7,0 cm de haut. Il pourrait tourner dans le sens anti-horaire à la vitesse de 20 ~ 70 rotations par minute (rpm). Onze cycles de rayures noires et blanches sont tracées sur un papier calque qui ont adhéré à l'extérieur du tambour. Le système d'éclairage est composé de deux tubes de lumière cercle dans 21 cm de diamètre.

Figure 1. Le modèle de l'éponge. La falaise fait dans ce milieu est de s'assurer que le champ visuel n'était pas protégé.

1. Une éponge comme indiqué dans la Fig.1 composée par deux parties. La partie gauche est la longueur de 3 cm x 3 cm x largeur de 2 cm de haut. La partie droite est la longueur de 3 cm x largeur x 3 cm 3 cm de haut.
2. Mettez cette éponge dans le fond de la chambre de poisson et versez l'eau d'élevage dans environ 2 cm de profondeur. Bulles d'air qui se cachent dans l'éponge doit être chassés.
3. Insérez une épingle à l'avant de la partie droite de l'éponge, d'environ 2 mm derrière la falaise.
4. Anesthetize une zèbre adulte dans le MS-222.
5. Mettez le poisson zèbre sur l'éponge avec jusqu'à dorsale et permettent d'un côté de sa nageoire pectorale avant la première épingle.
6. La seconde broche est insérée derrière la nageoire pectorale d'autres. Il pourrait éviter le poisson-zèbre le corps diminue en coopérant avec la première épingle (voir aussi la fig. 2).
7. Pince sa queue avec une artère pince et fixer la pince artère dans un morceau de caoutchouc (pâte à modeler) qui est collée sur la chambre de poisson.
8. La broche troisième et quatrième est planté dans le site près du cloaque pores corps du poisson. Il pourrait empêcher le poisson-zèbre à l'onde de sa queue intensément.
9. Le cinquième est situé broches entre la première et la troisième broche puis l'épingle sixième est de l'autre côté d'elle. Ils pourraient empêcher le poisson-zèbre de secouer son corps.
10. Les septième et huitième broches est inséré dans les sites à proximité de la branchie de garder la tête de l'orientation.
11. Verser l'eau d'élevage dans la chambre de poissons.
12. Après le poisson zèbre se réveille, laissez-le s'adapter pendant 5 ~ 10 minutes.
13. Allumer la lumière de cet appareil et laissez le poisson-zèbre adapter ce type d'éclairage pendant 2 minutes.
14. Allumez le moteur pour entraîner le réseau et permettent d'adapter le poisson zèbre pendant 1 minute.
15. Allumez la caméra et d'enregistrer le mouvement des yeux.
16. Analyser les ⁶ angles de vue et les numéros de saccade sur votre ordinateur personnel (Un exemple représentatif de l'œil les angles de l'analyse est montré dans Fig.2).

Figure 2. L'angle entre l'axe des yeux et l'axe du corps.

a) Lorsque la direction du réseau est-à-nez temporelle, nous avons défini l'angle au devant du corps du poisson est un angle négatif et l'angle au corps de poisson est un angle positif, et vice versa (pour revue voir aussi brève Réf. 6). Numéros de cette figure représentent la séquence des épingles.

b) par exemple l'analyse d'un OKR poissons dans le groupe normal. Un film d'une seconde a été transféré à une série de cadres et les angles des yeux de chaque cadre a été mesurée avec Image-Pro Plus logiciels. Chaque point dans ce chiffre représente chaque image, nous avons mesuré.

Notes:

1. Toutes les broches sont simplement utilisés pour empêcher le poisson-zèbre de secouer son corps, trop serré sera nocif pour les poissons.
2. Pince artère pourrait endommager la queue comme sa surface de contact est faible. Une fois la queue est libre, il est très difficile de fixer ce poisson. Enveloppez un bandage autour de la queue est recommandée dans certaines conditions.
3. Les septième et huitième broches qui sont plantés dans le site près des branchies ne doit pas être à l'abri de leur vue de caillebotis.

Partie III. OKR des larves de poisson zèbre

1. Méthylcellulose

Les larves de poisson zèbre peut être immobilisé dans une solution de méthylcellulose à 6% tandis garder vivant pendant une longue période. Préparer une solution de méthylcellulose comme suit.

1. Faire bouillir 200 ml ddH ₂ O dans un four à micro-ondes pendant environ 3 minutes au plus haut niveau.
2. Transfert de l'eau chaude pour une plaque de cuisson en remuant et mélangez vigoureusement.
3. Ajouter 12 g de méthylcellulose dans l'eau chaude progressivement.
4. Gardez en remuant pendant 3 minutes après la méthylcellulose est bien dispersé.
5. Refroidir les solutions avec de l'eau glacée jusqu'à ce qu'elle devienne claire, puis le placer à 4 ° C.

1. Deux paires mâle et une femelle adulte du poisson zèbre dans un réservoir d'accouplement à 17:00 après la tétée. Le lendemain matin, les transférer à un réservoir d'accouplement frais et collecter des embryons après 1 heure.
2. Les œufs sont maintenues dans un milieu d'embryon dans un incubateur à 28,5 ± 0,5 ° C avec la lumière: le cycle sombre de 14h10.
3. Les oeufs seront éclos à 48 heures après fécondation (HPF) et l'OKR sera testé à 72 HPF ou plus tard. Dans cette vidéo, les larves sont à 5 DPF.

3. Procédure d'OKR

1. Mettez l'appareil sous le stéréoscope équipé d'une caméra CCD et allumer la lumière de cet appareil.
2. Ajouter 20 ml méthycellulose 6% dans un plat de 55 mm de Pétri.
3. Placez larves plusieurs fois de suite au centre de ce plat.
4. Mettez une bulle d'air sur un volume de 1 pl dans le champ de la caméra, il pourrait être aussi un miroir pour refléter l'orientation de la grille.
5. Allumez le moteur et enregistrer les mouvements de leurs yeux.

Partie IV. OMR des adultes Zebrafish

Adulte zèbre OMR pourrait également être réalisées avec cet appareil, il suffit de placer une colonne dans la chambre de poisson pour prévenir les poissons nageant dans le centre (montré dans Fig.3a, la vitesse de rotation est de 36 min, noir-blanc cycles sont 11).

1. Mettez le poisson dans cette chambre de poisson.
2. Support d'une colonne de 2 cm de diamètre au centre de cette chambre de poisson.
3. Adapter une minute à la fois dans le reste de râpage et caillebotis de rotation.
4. Enregistrement du mouvement du poisson zèbre.
5. Analyser le taux de coïncidence de temps sur votre ordinateur personnel (un exemple est montré dans Fig.3b, la vitesse de rotation est de 36 min, noir-blanc du cycle est de 11)

Figure 3. OMR du poisson zèbre adulte. (A) Une colonne blanche plastiques a été placé au centre de la chambre de poisson pour prévenir les poissons qui nagent à travers elle. (B) Le taux de coïncidence de poisson zèbre adulte après la grille. Le taux de coïncidence était défini comme la proportion du temps caillebotis suivantes pour la durée d'enregistrement totale. La valeur de 50% indique que le poisson nage au hasard alors que 100% indique la grille suivante poissons très bien. Les deux nerfs optiques ont été écrasés avec une pince bijoux environ 10 secondes. Le comportement de l'OMR est apparu comme une nage aléatoire après écrasement.

Discussion

Selon la définition de l'OKR, c'est un phénomène que les animaux déplacer leurs yeux pour poursuivre une grille tournante spontanément. Si ce comportement a été menée pendant une longue période (par exemple, plus de 6 heures), les muscles de l'oeil peut-être fatigué et le OKR sera atténuée.

Adulte zèbre OMR a été complètement décrite par les autres ^7. Dans cette vidéo, nous venons de vous montrer ce comportement avec notre appareil. Une fois les nerfs optiques sont écrasés, ils ne pouvaient pas suivre cette grille très bien.

Nous avons effectué de test de comportement chez les adultes OKR, le poisson-zèbre larvaires et les adultes OMR avec nos personnalisé simple construit un appareil pour évaluer la fonction visuelle du poisson zèbre. Ce test OKR du poisson zèbre adulte dans notre expérience pourrait garder assez forts dans un délai de 4 heures sans lui nuire. Cela pourrait ouvrir OKR test dans l'étude des poissons adultes fonctions plus efficacement.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385	Viscosity 25 cP