Summary
Optokinetic प्रतिक्रिया व्यापक रूप से किया गया है लार्वा zebrafish का दृश्य कार्यों का आकलन किया. फिर भी, लार्वा मछली के लिए मानक प्रोटोकॉल अभी तक आसानी से वयस्कों में लागू नहीं है
Abstract
Optokinetic प्रतिक्रिया (OKR) एक व्यवहार है कि एक जानवर अपनी आँखें vibrates इसे चारों ओर एक rotating झंझरी का पालन है. यह व्यापक रूप से किया गया है लार्वा zebrafish 1-5 के दृश्य कार्यों का आकलन किया. फिर भी, अभी तक लार्वा मछली के लिए मानक प्रोटोकॉल तत्काल वयस्क zabrafish में लागू नहीं है. यहाँ, हम परिचय कैसे को मापने के लिए हमारी सरल कस्टम निर्मित एक नए प्रोटोकॉल है जो हमारी प्रयोगशाला में स्थापित है का उपयोग तंत्र के साथ वयस्क zebrafish के OKR. हमारे दोनों तंत्र और वयस्क zebrafish में OKR के कदम दर कदम प्रक्रिया के इस वीडियो में सचित्र हैं. इसके अलावा, लार्वा OKR की माप के रूप में के रूप में अच्छी तरह से optomotor (OMR) प्रतिक्रिया वयस्क zebrafish का परीक्षण भी इस वीडियो में प्रदर्शन कर रहे हैं. हमारे प्रयोग में वयस्क zebrafish का यह OKR परख करने के लिए 4 घंटे के लिए पिछले कर सकते हैं. इस तरह OKR वयस्क मछली में लागू परीक्षण दृश्य समारोह की जांच करने के लिए और अधिक कुशलता से लाभ जब वयस्क मछली दृष्टि प्रणाली चालाकी है.
सु - क्यूई Zou और वू यिन इस पत्र के लिए समान रूप से योगदान दिया.
Protocol
I भाग: OKR तंत्र का निर्माण
विवरण वीडियो प्रदर्शन में दिखाया गया है हैं.
भाग द्वितीय: वयस्क Zebrafish के OKR
यदि आपके प्रयोगशाला OKR तंत्र का निर्माण किया गया है, वयस्क zebrafish OKR की कुंजी के लिए मछली पकड़ है. इस भाग में, हम आप कदम से कदम दिखाएगा.
हमारे तंत्र में निम्नलिखित उल्लेख किया है दूसरों के समान भागों composes. परिपत्र मछली कक्ष बाहरी व्यास में 7.0 सेमी, भीतरी व्यास में 6.5 सेमी और उच्च में 7.0 सेमी है. मछली कक्ष के आसपास ड्रम बाहर व्यास में 8.5 सेमी, भीतरी व्यास में 7.5 सेमी और उच्च में 7.0 सेमी है. यह दक्षिणावर्त और काउंटर दक्षिणावर्त गति के साथ 20 से घुमाएगी सकता ~ मिनट 70 प्रति rotations (rpm). काले और सफेद धारियों के ग्यारह चक्र अनुरेखण कागज जो ड्रम के बाहर पर पालन पर तैयार कर रहे हैं. 21 सेमी व्यास में दो चक्र प्रकाश ट्यूबों के प्रकाश प्रणाली बना है.
चित्रा 1. स्पंज के मॉडल. इस बीच में बनाया चट्टान को यकीन है कि दृश्य क्षेत्र आश्रय नहीं किया जा रहा था .
- एक स्पंज के रूप में Fig.1 में दिखाया में दो भागों से बना है. बाएं हिस्से में 3 सेमी x चौड़ाई 3 सेमी x उच्च 2 सेमी लंबाई है. सही भाग 3 सेमी x चौड़ाई 3 सेमी x उच्च 3 सेमी लंबाई है.
- मछली के चैम्बर के तल में इस स्पंज रखो और पालन के बारे में 2 सेमी की गहराई में पानी डालना. हवा बुलबुला जो स्पंज में छिपा बाहर प्रेरित किया जाना चाहिए.
- स्पंज के सही भाग के सामने चट्टान के पीछे 2 मिमी के बारे में एक पिन डालें.
- MS-222 में एक वयस्क zebrafish anesthetize.
- स्पंज पर पृष्ठीय अप के साथ zebrafish और रखो पहली पिन से पहले अपनी छाती पर का कवच पंख के एक तरफ की अनुमति.
- दूसरा पिन अन्य छाती पर का कवच पंख के पीछे डाला जाता है. यह पहली पिन (भी चित्र में देख 2.) के साथ सहयोग के द्वारा zebrafish सिकुड़ शरीर से बचने के सकता है.
- इसकी पूंछ के साथ एक धमनी दबाना और रबर का एक टुकड़ा (क्ले मॉडलिंग) है जो मछली कक्ष पर पालन में धमनी दबाना तय क्लैंप.
- तीसरे और चौथे पिन मछली शरीर के cloacal ताकना के पास साइट में बोया जाता है. यह zebrafish को रोकने के लिए अपनी पूंछ लहर तीव्रता सकता.
- पांचवें पिन के बीच पहली और तीसरी पिन और फिर छठे पिन के दूसरे पक्ष पर है sited है. वे अपने शरीर हिला से zebrafish को रोकने सकता है.
- सातवें और आठवें पिन गिल के पास साइटों में सम्मिलित किया जाता है सिर अभिविन्यास रखने के लिए.
- मछली कक्ष में पालन पानी डालो.
- Zebrafish के बाद जाग, यह 5 ~ 10 मिनट के लिए अनुकूल है.
- इस तंत्र के प्रकाश पर स्विच और zebrafish 2 मिनट के लिए इस प्रकाश का अनुकूलन.
- मोटर पर स्विच झंझरी ड्राइव और 1 मिनट के लिए अनुकूल zebrafish की अनुमति करने के लिए.
- कैमरे पर मुड़ें और आँखों के आंदोलन रिकॉर्ड.
- आपके पर्सनल कंप्यूटर (आँख कोण विश्लेषण के एक प्रतिनिधि उदाहरण Fig.2 में दिखाया गया है) पर आँख 6 कोण और saccade संख्या का विश्लेषण .
चित्रा 2. आँख अक्ष और शरीर अक्ष के बीच का कोण.
) एक झंझरी की दिशा नाक को जब अस्थायी है, हम मछली शरीर के आगे कोण परिभाषित किया गया है एक नकारात्मक कोण और कोण मछली के शरीर पर एक सकारात्मक कोण, इसके विपरीत (संक्षिप्त समीक्षा के लिए भी रेफरी देख. ) 6. इस आंकड़े में नंबर पिन के अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं.
ख) OKR सामान्य समूह में एक मछली से विश्लेषण उदाहरण. एक फिल्म में एक दूसरे को एक श्रृंखला फ्रेम को हस्तांतरित किया गया और प्रत्येक फ्रेम की आंख कोण छवि समर्थक प्लस सॉफ्टवेयर के साथ मापा गया था. इस आंकड़े में प्रत्येक बिंदु के प्रत्येक फ्रेम हम मापा का प्रतिनिधित्व करता है.
नोट:
- सभी पिन बस के लिए अपने शरीर हिला से zebrafish को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है, भी तंग मछली के लिए हानिकारक होगा.
- धमनी दबाना पूंछ क्षति के रूप में अपने संपर्क क्षेत्र छोटा है हो सकता है. एक बार पूंछ मुक्त है, यह बहुत मुश्किल है इस मछली को ठीक करने के लिए. कुछ हालत में सिफारिश की पूंछ के चारों ओर एक पट्टी लपेटें.
- सातवें और आठवें पिन जो गिल के पास साइट में लगाए हैं आश्रय उनके झंझरी की दृष्टि से नहीं होना चाहिए.
भाग III. लारवल Zebrafish के OKR
1. Methylcellulose
लारवल zebrafish 6% methylcellulose समाधान में immobilized किया जा सकता है, जबकि एक लंबे समय के लिए जीवित रखने के. के रूप में methylcellulose समाधान तैयार करें.
- उबाल लें उच्च स्तर पर 3 मिनट के बारे में माइक्रोवेव ओवन में 200 मिलीग्राम DDH 2 हे.
- एक भावप्रवण hotplate को गर्म पानी स्थानांतरण और यह तेजी से हलचल.
- धीरे धीरे गर्म पानी में 12 ग्राम methylcellulose जोड़ें.
- 3 मिनट के लिए सरगर्मी के बाद methylcellulose अच्छी तरह से छितरी हुई है रहो.
- बर्फ के पानी के साथ समाधान कूल जब तक यह स्पष्ट हो जाता है, और फिर यह 4 में जगह डिग्री सेल्सियस
- दो पुरुष और एक संभोग टैंक में वयस्क zebrafish के भोजन के बाद 17:00 पर महिला जोड़े. अगली सुबह उन्हें एक ताजा संभोग टैंक को हस्तांतरण और 1 घंटे के बाद भ्रूण को इकट्ठा.
- 14:10 के अंधेरे: चक्र अंडे भ्रूण मध्यम में 28.5 0.5 ± ° सी इनक्यूबेटर में प्रकाश के साथ रखा जाता है.
- अंडे 48 घंटे के पोस्ट निषेचन (HPF) पर बाहर रची जाएगा और OKR 72 HPF या बाद में परीक्षण किया जाएगा. इस वीडियो में, larvaes 5 DPF पर हैं.
3. OKR की प्रक्रिया
- सीसीडी कैमरा और इस तंत्र के प्रकाश पर स्विच के साथ सुसज्जित स्टिरियोस्कोप के तहत तंत्र रखो.
- एक 55 मिमी पेट्री डिश में 20 मिली 6% methycellulose जोड़ें.
- इस डिश के केंद्र में एक पंक्ति में कई larvaes रखें.
- कैमरा क्षेत्र में 1 μl की एक मात्रा के बारे में एक हवाई बुलबुले रखो, यह एक दर्पण के रूप में झंझरी की दिशा को प्रतिबिंबित सकता है.
- मोटर पर स्विच और उनकी आंखों के आंदोलन रिकॉर्ड.
भाग IV. वयस्क Zebrafish के OMR
वयस्क zebrafish OMR भी इस तंत्र के साथ आयोजित किया जा सकता है, सिर्फ मछली कक्ष में केन्द्र भर में मछली तैराकी रोकने के लिए एक स्तंभ (Fig.3a में दिखाया है, घूर्णन वेग 36 आरपीएम, काले सफेद चक्र 11) जगह.
- इस मछली कक्ष में एक मछली रखो.
- इस मछली चैम्बर के केंद्र में 2 सेमी व्यास का एक स्तंभ खड़े हो जाओ.
- दोनों अभी भी झंझरी और रोटेशन झंझरी में एक मिनट के लिए अनुकूलन.
- Zebrafish के आंदोलन का रिकार्ड है.
- आपके पर्सनल कंप्यूटर पर संयोग समय की दर का विश्लेषण (एक उदाहरण Fig.3b में दिखाया गया है, घूर्णन वेग 36 rpm है, काले सफेद चक्र 11)
चित्रा 3. वयस्क Zebrafish के OMR. (क) एक सफेद प्लास्टिक स्तंभ इसे भर में मछली तैराकी रोकने के लिए मछली के चैम्बर के केंद्र में रखा गया था. (ख) वयस्क zebrafish के संयोग दर झंझरी के बाद. संयोग दर निम्नलिखित झंझरी कुल रिकॉर्डिंग समय के लिए समय के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया था. 50% के मूल्य इंगित करता है कि बेतरतीब ढंग से मछली तैराकी है, जबकि 100% मछली निम्नलिखित झंझरी बहुत अच्छी तरह से इंगित करता है. दोनों ऑप्टिक नसों 10 सेकंड के बारे में एक गहने संदंश के साथ कुचल दिया गया. OMR के व्यवहार को कुचलने के बाद एक यादृच्छिक तैराकी के रूप में दिखाई दिया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OKR की परिभाषा के अनुसार, यह एक घटना है कि जानवरों उनकी आँखों को स्थानांतरित करने के लिए एक rotating झंझरी अनायास का पीछा है. यदि यह व्यवहार एक लंबे समय के 6 घंटे से ऊपर (जैसे) के लिए आयोजित किया गया है, आंख की मांसपेशियों और थक गया हो सकता है OKR तनु जाएगा.
वयस्क zebrafish OMR को 7 दूसरों के द्वारा किया गया है पूरी तरह से वर्णित है. इस वीडियो में, हम सिर्फ आप हमारे तंत्र के साथ इस व्यवहार दिखाते हैं. एक बार ऑप्टिक नसों कुचल कर रहे हैं, वे बहुत अच्छी तरह से इस झंझरी का पालन नहीं सकता.
हम वयस्क, लार्वा और वयस्कों में zebrafish OMR में OKR व्यवहार परीक्षण किया है हमारी सरल कस्टम निर्मित तंत्र के साथ zebrafish के दृश्य समारोह का मूल्यांकन. हमारे प्रयोग में वयस्क zebrafish का यह OKR परख 4 घंटे की अवधि के भीतर यह हानि के बिना काफी मजबूत रख सकता है. यह वयस्क मछली समारोह अध्ययन में OKR परीक्षण और अधिक कुशलता से खोल सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम उसके समर्थन के लिए सुश्री फैन शेन zebrafish पालन करने के लिए धन्यवाद. यह डा. बिंग हू (चीनी विज्ञान अकादमी, "बाई रेन जी हुआ", 30870833 NSFC और चीन के राष्ट्रीय मूल विज्ञान कार्यक्रम, 2009CB941302) fundings के द्वारा समर्थित है.
सभी पशु प्रयोगों विश्वविद्यालय विज्ञान और प्रौद्योगिकी (USTC) चीन पशु संसाधन केंद्र और विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के के द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार आयोजित की गई.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385 | Viscosity 25 cP |
References
- Beck, J., Gilland, E., Tank, D., Baker, R. Quantifying the Ontogeny of Optokinetic and Vestibuloocular Behaviors in Zebrafish Medaka, and Goldfish. J Neurophysiol. 92, 3546-3561 (2004).
- Brockerhoff, S. Measuring the optokinetic response of zebrafish larvae. Nature Protocols. 1, 2448-2451 (2006).
- Emran, F. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 19126-19131 (2007).
- Rinner, O., Rick, J., Neuhauss, S. Contrast Sensitivity, Spatial and Temporal Tuning of the Larval Zebrafish Optokinetic Response. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 137-142 (2005).
- Roeser, T., Baier, H. Visuomotor Behaviors in Larval Zebrafish after GFP-Guided Laser Ablation of the Optic Tectum. The Journal of Neuroscience. 23, 3726-3734 (2003).
- Easter, S., Nicola, G. The Development of Vision in the Zebrafish (Danio rerio). Developmental Biology. 180, 646-663 (1996).
- Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43, 21-30 (2003).
