Summary
Optokinetic 응답 널리 애벌레 zebrafish의 시각 기능을 평가하기 위해 사용되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 애벌레 물고기를위한 표준 프로토콜은 아직 성인에 즉시 적용되지 않습니다
Abstract
Optokinetic 응답 (OKR)은 동물이 주변에 회전 격자를 수행하기 위해 눈을 진동하는 동작입니다. 그것은 널리 애벌레 zebrafish 1-5의 시각 기능을 평가하기 위해 사용되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 애벌레 물고기를위한 표준 프로토콜은 아직 성인 zabrafish에 즉시 적용되지 않습니다. 여기, 우리 연구실에 설립하는 새로운 프로토콜을 사용하여 간단한 사용자 지정 - 내장된 장치와 성인 zebrafish의 OKR을 측정하는 방법을 소개합니다. 우리의 장치 및 성인 zebrafish에 OKR의 단계별 절차를 모두이 동영상에 그림입니다. 또한, 애벌레 OKR의 측정뿐만 아니라 optomotor 응답 (OMR) 성인 zebrafish의 시험은 또한이 동영상에서 시연하고 있습니다. 우리의 실험에서 성인 zebrafish의 OKR 분석은 최대 4 시간까지 마지막 수 있습니다. 성인 피시 비전 시스템을 조작할 때 성인 물고기에 적용 이러한 OKR 시험은보다 효율적으로 시각적 기능 조사에 도움이 될 것입니다.
스와 - 치 Zou과 우 인이 종이에 똑같이 기여.
Protocol
부 I : OKR 장치 구축
자세한 사항은 비디오 데모에 표시됩니다.
부 II : 성인 Zebrafish의 OKR
당신의 실험실 OKR 장치를 구축있다면, 성인 zebrafish OKR의 핵심은 물고기를 잡고있다. 이 부분에서, 우리는 당신이 단계적으로 표시됩니다.
우리기구는 언급된 다른 유사한 다음과 같은 부분을 작곡. 원형 물고기 챔버 외부 직경 7.0 cm, 내경 6.5 cm 높은 7.0 cm입니다. 생선 실 주위에 드럼 밖으로 직경 8.5 cm, 내부 직경 7.5 cm 높은 7.0 cm입니다. 그것은 시계 방향으로 20의 속도로 시계 반대 방향으로 회전 수 분마다 ~ 70 회전 (RPM). 검은색과 흰색 줄무늬의 열 사이클은 드럼의 외부에 붙어 추적 종이에 그려져 있습니다. 조명 시스템은 21cm 직경의 두 원형 라이트 튜브로 구성되어 있습니다.
그림 1. 스폰지의 모델.이 중간에 만들어진 절벽은 시야가 숨겨되지 않았는지 확인하는 것입니다.
- 로 Fig.1에 표시된 스펀지는 두 부분으로 구성되어 있습니다. 왼쪽 부분은 3cm X 폭 3cm X 높이 2cm 길이입니다. 오른쪽 부분은 길이가 3cm는 X 폭 3cm X 높이 3cm입니다.
- 물고기 챔버의 바닥에 스펀지를 넣고 약 2 cm 깊이의 양육 물을 부어. 스폰지에 숨어 공기 방울은 사라졌어해야합니다.
- 절벽 뒤에 2mm 정도 스폰지의 오른쪽 부분의 앞에 핀을 삽입합니다.
- MS - 222의 성인 zebrafish를 마취.
- 지느러미 최대로 스펀지에 zebrafish를 넣고 첫 번째 핀하기 전에 가슴 지느러미의 한쪽을 허용합니다.
- 두 번째 핀은 다른 가슴 지느러미 뒤에 삽입됩니다. 그것은 첫 번째 핀 (그림도 참조하십시오. 2)와 협력하여 zebrafish 축소 시신을 피할 수 있습니다.
- 동맥이 물고기 챔버에 준수는 고무의 조각 (모델링 점토)에 동맥 클램프 클램프 및 수정과 꼬리를 고정.
- 세 번째와 네 번째 PIN은 물고기 신체의 cloacal 구멍 근처의 사이트에 심어져 있습니다. 그것은 심각하게 꼬리를 흔들 zebrafish을 방지 수 있습니다.
- 다섯 번째 PIN은 여섯 번째 핀 그것의 반대편에있는 다음 첫 번째와 세 번째 핀 사이 sited입니다. 그들은 몸을 흔들어에서 zebrafish를 방지 수 있습니다.
- 일곱째와 여덟째 PIN은 머리 방향을 유지하는 길 근처의 사이트에 삽입됩니다.
- 물고기 챔버의 양육 물을 붓고.
- zebrafish가 깨어나면 후, 5 ~ 10 분 정도 적응하자.
- 이 장치의 빛이 스위치를 켜고 zebrafish 2 분 동안이 조명을 적응하자.
- 격자를 운전하고 1 분 적응 zebrafish 수 있도록 모터에 스위치.
- 카메라의 전원을 켜고 눈을의 움직임을 기록합니다.
- 개인용 컴퓨터 (눈 각도 분석 대표 예제는 Fig.2에 표시됩니다)에 눈 각도 6 saccade 번호를 분석합니다.
그림 2. 안과 축 및 신체 축 사이의 각도.
A)하면 격자의 방향은 비강 - 투 - 시간적이다, 우리는 부정적인 각도는 물고기 신체의 앞으로의 각도를 정의하고 생선 본문의 각도가 긍정적인 각도, 반대 (간략한 검토도 참조를 참조합니다. 6). 이 그림에서 숫자는 핀의 순서를 나타냅니다.
일반 그룹에서 한 생선 B) OKR 분석 예. 1 초 영화는 일련의 프레임에 전송되어 각 프레임의 눈 각도는 이미지 프로 플러스 소프트웨어로 측정되었다. 이 그림의 각 요점은 우리가 측정한 각 프레임을 나타냅니다.
참고 :
- 모든 핀이 단지의 몸을 흔들어에서 zebrafish을 방지하는 데 사용됩니다, 너무 꽉 물고기에 해로운 것입니다.
- 의 접촉 면적이 작은 같은 동맥 클램프가 꼬리를 손상 수 있습니다. 꼬리 무료되면,이 물고기를 수정하는 것은 매우 어렵습 S. 어떤 상태에서 권장 꼬리 주위에 붕대를 바꿈.
- 아가미 근처의 사이트에 심어져 있습니다 일곱째와 여덟째 핀은 격자 그들의 시야에서 피난처해서는 안됩니다.
부 III. 애벌레 Zebrafish의 OKR
1. 메틸 셀룰로오스
오랫동안 살아남으 동안 애벌레 zebrafish는 6 % 메틸 셀룰로오스 용액에 고정하실 수 있습니다. 다음과 같이 메틸 셀룰로오스 용액을 준비합니다.
- 높은 수준에서 약 3 분 전자렌지에 넣어 익히지 200 ML ddH 2 O.
- 감동 열판에 온천수를 전송하고 적극적으로 그것을 저어.
- 점차 뜨거운 물에 12g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다.
- 메틸 셀룰로오스가 잘 분산 후 3 분 저어 유지.
- 그것이 분명해진다 때까지 얼음물과 솔루션을 쿨 다음 4를 장소 ° C.
- 쌍이 남성과 수유 후 17:00 짝짓기 탱크에 성인 zebrafish의 여성. 다음날 아침은 신선한 짝짓기 탱크로 전송하고 1 시간 뒤에 배아를 수집합니다.
- 14시 10분의 어두운주기 : 계란은 불빛과 28.5 ± 0.5 ° C가 인큐베이터에서 배아 매체에 보관됩니다.
- 계란은 48 시간 포스트 수정 (HPF)에서 부화되며 OKR은 나중에 72 HPF하거나 테스트합니다. 이 비디오에서는 larvaes 5 DPF에 있습니다.
3. OKR 절차
- CCD 카메라 및이 장치의 빛을 스위치를 갖춘 입체경 아래의 장치를 넣어.
- 55 - mm 배양 접시에 20 ML 6 % 프로필 메틸 셀룰로오스를 추가합니다.
- 이 접시의 중앙에 연속으로 여러 larvaes를 배치합니다.
- 카메라 분야 1 μl의 볼륨에 대한 공기 방울을 넣어, 그것은 격자의 방향을 반영하는 거울로서 수 있습니다.
- 모터에 스위치와 그들의 눈을의 움직임을 기록합니다.
부 IV. 성인 Zebrafish의 OMR
성인 zebrafish OMR 또한이 장치와 함께 진행 될 수 단지 (회전 속도는 흑백 사이클은 11아르 36 RPM이며, Fig.3a에서 보여준) 센터를 통해 물고기 수영을 방지하기위한 물고기 챔버에 칼럼을 넣으십시오.
- 이 생선 챔버에 물고기를 넣어.
- 이 물고기 챔버의 중앙에 2cm 직경의 열을하라.
- 둘 다 살아남 격자 및 순환 격자 한 분간 적응.
- zebrafish의 움직임을 기록합니다.
- 귀하의 개인 컴퓨터에 시간을 우연 속도를 분석 (예제 Fig.3b에 표시됩니다, 회전 속도가 36 RPM이며, 흑백주기 11)
그림 3. 성인 Zebrafish의 OMR. (A) 흰색 플라스틱 칼럼 그것에 걸쳐 물고기 수영을 방지하기위한 물고기 챔버의 중앙에 위치했다. (B) 성인 zebrafish의 우연 속도는 격자를 따라. 우연의 일치 비율은 총 녹음 시간은 다음 격자 시간의 비율로 정의했다. 50 % 가치는 100 % 잘 생선 다음과 같은 격자를 나타내며 물고기가 무작위로 수영장을 나타냅니다. 두 광학 신경은 10 초 정도 보석 포셉로 깔린했다. OMR의 동작은 호감 후 임의의 수영으로 나타났다.
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Discussion
OKR의 정의에 따르면, 그것은 동물들이 저절로 회전 격자를 추구하기 위해 눈을 이동하는 현상입니다. 이 문제는 오랜 시간 (6 시간 이상 등)에 대해 실시되고있다면, 눈 근육이 피곤 수 있으며 OKR는 감쇠됩니다.
성인 zebrafish OMR은 다른 7 완벽하게 설명했습니다. 이 비디오에서는, 우리는 당신에게 우리의 장치와 함께 동작을 보여줍니다. 광학 신경이 짓눌린되면, 그들은 잘이 격자를 수행하지 못했습니다.
우리는 zebrafish의 시각 기능을 평가하기 위해 간단한 사용자 정의 - 기본 장치와 성인 성인, 애벌레 zebrafish 및 OMR에서 OKR 동작 테스트를 수행했습니다. 우리의 실험에서 성인 zebrafish의 OKR 분석 그것을 해치지 않고 4 시간 기간 내에 충분히 강한 유지할 수 있습니다. 이것은보다 효율적으로 성인 물고기 기능 연구에 OKR 테스트를 열 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 zebrafish 양육 그녀의 지원을 위해 양 팬 쉔 감사합니다. 이것은 박사 빙 후진타오 (중국 과학 아카데미, "바이 랜 지 후아"NSFC 30870833 중국 국립 기본 과학 프로그램, 2009CB941302)에 fundings에 의해 지원됩니다.
모든 동물 실험은 과학 및 중국 (USTC) 동물 자원 센터와 대학 동물 케어 및 사용위원회의 기술 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 실시되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385 | Viscosity 25 cP |
References
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