果蝇聚乙烯南瓜抗体标记染色体的制备

Summary

该视频协议说明在约翰森实验室中使用的壁球技术准备

Abstract

果蝇一直喜爱的模型系统研究由于聚乙烯染色体三龄幼虫的巨大唾液腺提供细胞学优势的染色质结构和基因调控之间的关系。在这个组织中的染色体在细胞分工上升到约1000份的情况下进行多轮的复制。的DNA仍然大大扩大提供一个独特的机会，到相关的特定蛋白质的本地化染色质形态的染色体复制后每个周期相一致。因此，出现了一个高水平的界定目前在不同的基因的表观遗传修饰和转录过程的不同阶段的兴趣。为此类研究的重要工具，是与抗体的酶标记的聚乙烯染色体，转录因子，或感兴趣的组蛋白修饰。这个视频协议说明，在约翰森实验室用于制备抗体标记果蝇多线染色体的壁球技术。

Protocol

聚乙烯染色体壁球准备以下协议是改编自约翰森等人所描述的程序。 （2009年）。

1。文化的第三龄果蝇幼虫

为了获得高品质壁球制剂的最佳聚乙烯染色体，拥挤的培养条件是必不可少的（即大约20个鸡蛋在一个标准的4个“飞瓶和变化到一个新的瓶子铺设雌性果蝇每天），选择最胖的个人从第一次攀登，而他们仍然徘徊，但只是到化蛹前幼虫3龄作物。我们经常文化在21 ° C，但18 ° C将产生丰厚的染色体可能如一些更适合例如当乐队/带间地区需要在高分辨率显示。

2。聚乙烯壁球材料

• 德拉蒙德清扫钳（2）
• 培养皿（60 × 15毫米）
• 磨砂显微镜载玻片（费舍尔号12-544-3）（多聚赖氨酸涂层）
• 22 × 22毫米15号盖玻片（费舍尔第12号- 520B）（Sigmacote涂层;西格玛＃SL2）
• 22 × 40毫米15号盖玻片（费舍尔12号- 530B）
• 金，湿巾
• 20X目标相显微镜
• 小杜瓦（例如，真空瓶或保温瓶瓶）
• 长钳
• 剃刀刀片
• Coplin坛
• 橡胶女佣或特百惠托盘（或同等学历密封的纸盒）
• 封口膜（切成22毫米平方）
• 175克重量

3。定影液和解决方案

1. 5X甲醛股票。准备一个新鲜的溶液为0.74克多聚甲醛在4.0毫升的DH _{2 O} 28μL1N氢氧化钾。加热至65 ° C至解散的多聚甲醛，然后储存在​​冰。
2. 固定液1。准备一个0.5毫升10X PBS，50μLTRITON X - 100，3.45毫升的dh ₂ O和1.0毫升的新鲜的解决方案，从5倍的甲醛存量。温暖驱散TRITON X - 100，使用1小时内。
3. 固色剂2。准备一个1.5毫升的dh _{2 O，2.5} mL冰醋酸，5倍的股票和1小时内使用甲醛和1.0毫升的新鲜解决方案。
4. Lactoacetic酸溶液。准备1毫升乳酸，DH _{2 O} 2毫升，3毫升醋酸溶液。

4。聚乙烯染色体壁球准备：

1. 用清水冲洗幼虫和转让，以PBS在解剖组织培养皿。
2. 口与一对镊子挂钩把握的提示，按住约2 / 3的方式与其他对身体，拉口钩，使唾液腺被暴露。单独从大脑的唾液腺和眼睛触角光盘，并剖析远离腺体脂肪体和任何其他相关的组织。
3. 新增的两个以及抑郁症的幻灯片的第一口井和200-300微升至固定液2以及两个200固定液1微升。一次传输一对唾液腺固定液1井一和孵化为目标抗原表位所需的金额，时间，一般约1-2分钟。 （注：如大多数的组蛋白修饰某些抗原表位，可能需要5分钟或更长的固定。）
4. 使用镊子转移唾液腺固定液2以及2孵育两分钟。
5. 10-30μl在一个干净的Sigmacoted盖玻片Lactoacetic溶液的传输腺体。到盖玻片，轻轻地一个多聚赖氨酸涂层显微镜幻灯片，而不采用垂直压力，拿起盖玻片，使腺体之间的滑动和盖玻片。立即方便认真抓钳盖玻片上一个边缘细胞裂解和染色体蔓延并轻轻稍微来回移动，试图以尽量减少对组织的垂直压力。另外，使用橡皮擦端甚至指尖轻轻地来回移动盖玻片。请注意，在来回移动盖玻片的任何延迟可能减少染色体蔓延，因为他们往往​​会成为一经曝光Lactoacetic溶液，更严格的。混浊的解决方案往往是一个很好的迹象细胞分离。轻轻敲击盖玻片斜刺（避免垂直压力）与橡皮擦端了几次也可能协助染色体蔓延。
6. 立即组织检查，以确定是否染色体是良好的传播与20或40倍的目标相差显微镜下。
7. 当染色体的蔓延是足够的，盖玻片一侧设置滑下一叠干净的金，湿巾。将第二金抹在上面，扁平化的染色体，由你的拇指，放在盖玻片定位和紧迫坚决避免任何盖玻片，剪切横向运动染色体。
8. 检查再次在显微镜下的幻灯片，以确定是否准备适合预期的目的。如果染色体移动挤压后显着，使用在后续的准备工作Lactoacetic溶液量较少。重复步骤4.1-4.8，直到已经获得了足够数量的合适的幻灯片。将盖玻片的幻灯片后的175克的重量。
9. 用液态氮填充一个小杜瓦（如保温瓶）。用长镊子，直到停止沸腾，浸入_液态氮中的幻灯片，删除幻灯片，并立即用一个干净的刀片的边缘，在一个角落里翻转盖玻片。如果幻灯片将被立即使用，放置在一个用PBS Coplin JAR在4 ° C否则收集到的幻灯片，用95％乙醇填补了Coplin JAR。检查盖玻片，一旦霜冻已经升华了，以确认该组织坚持到幻灯片中，并没有保持与盖玻片。与其余幻灯片重复，直到所有的幻灯片都存储在任PBS（在几个小时内使用）或乙醇（期较长的存储）。

代表性的成果

获得高质量的聚乙烯壁球编制的第一个关键的一步，是成长与大唾液腺核脂肪幼虫。二是良好的技术与传播过程中，这可能需要一些练习。一个改进传播成功的秘诀是要找到在挤压步骤lactoacetic溶液的最小体积。这将促进足够，不会产生过多的流媒体的力量，可以洗染色体臂染色体蔓延。这也是值得注意的来回移动盖玻片的任何延迟将降低染色体蔓延，因为他们变得更加刚性Lactoacetic溶液时，接触到。

如果一切顺利的话，应该有许多很好的普及聚乙烯染色体。图1展示了这样一个准备的例子，双绿化带间地区的标志和标记用的染料，污渍在蓝色的带状地区。如果获得足够的蔓延，染色体看起来像小球，如图2所示。另一方面，如果过多很多传播已经发生，chomosomes太薄，延长或分散成小块，某些情况下，如在图3所示。

图1。聚乙烯壁球准备双标记抗体JIL - 1组蛋白H3S10激酶（红色）和赫斯特（蓝色）。

图2。聚乙烯壁球不足蔓延。

图3。聚乙烯壁球太多扩频。

Discussion

包含在传统壁球固定协议的醋酸和乳酸，有利于带间的决议和染色体臂蔓延，但不幸的是，一些抗原决定簇不生存之本治疗。这样一个抗原表位的一个例子是H3S10ph（ 蔡等 ，2008） 。由于酸的治疗也有它的缺点是淬火GFP标记的蛋白质，DiMario等固有荧光。 （2006年）最近开发的基于甲醛的“无酸壁球技术”，允许无酸敏感的抗原决定簇的抗体检测GFP抗体标记以及GFP融合蛋白聚乙烯染色体的直接可视化。此过程中的修改是进一步详细描述了在约翰森等 。 （2009年）。一个有代表性的酸固定聚乙烯壁球准备双标记抗体JIL - 1组蛋白H3S10激酶和Hoechst如图。 1。