Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l'etichettatura di anticorpi

Summary

Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen

Abstract

Drosophila è stata a lungo un sistema di preferiti modello per studiare la relazione tra struttura della cromatina e regolazione dei geni per i vantaggi citologico fornite dal cromosomi giganti ghiandola salivare polytene larve del terzo stadio. In questo tessuto i cromosomi subiscono molti cicli di replicazione in assenza di divisione cellulare dando luogo a circa 1000 copie. Il DNA rimane allineata dopo ogni ciclo replicativo conseguente cromosomi notevolmente allargata che forniscono una opportunità unica per correlare morfologia della cromatina con la localizzazione di specifiche proteine. Di conseguenza, c'è stato un elevato livello di interesse nella definizione delle modificazioni epigenetiche presenti in geni diversi e in diverse fasi del processo di trascrizione. Un importante strumento per tali studi è l'etichettatura dei cromosomi politenici con anticorpi per l'enzima, fattore di trascrizione o la modifica degli istoni di interesse. Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen Drosophila cromosomi politenici per l'etichettatura degli anticorpi.

Protocol

Il protocollo seguito per la preparazione di politene da squash cromosoma è adattato dalla procedura descritta in Johansen et al. (2009).

1. Cultura del terzo larve instar Drosophila

Al fine di ottenere ottimali cromosomi politenici per le preparazioni di alta qualità da squash, condizioni di coltura poco affollate sono essenziali (cioè, posto a circa 20 la deposizione delle uova le mosche femmina in uno standard 4 "bottiglia di volare e passare a una nuova bottiglia ogni giorno). Selezionare la più grassa individui dal primo raccolto di arrampicata 3 larve instar mentre sono ancora vaganti, ma appena prima di impupamento. rotazione abbiamo cultura a 21 ° C, ma 18 ° C produrrà più grassi cromosomi che possono essere più adatti per alcuni scopi come ad esempio quando la banda / regioni interbanda devono essere visualizzate ad alta risoluzione.

2. Materiali da squash polytene

• Pinza dissezione Drummond (2)
• Petri (60 x 15 mm)
• Vetrini da microscopio Frosted (Fisher n ° 12-544-3) (poli-lisina rivestita)
• 22 x 22 mm n. 15 coprioggetto (Fisher n ° 12-520B) (rivestito con Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm n. 15 coprioggetto (Fisher n ° 12-530B)
• Kim-salviette
• Microscopio a contrasto di fase con obiettivo 20X
• Piccolo Dewar (ad esempio, borraccia o thermos vuoto bottiglia)
• Pinze lunghe
• Lamette da barba
• Coplin Jar
• Gomma-Colf o vassoio Tupperware (o equivalente cassetto richiudibile)
• Parafilm (tagliato in 22 piazze mm)
• 175 g di peso

3. Fissativi e soluzioni

1. Magazzino formaldeide 5X. Preparare una soluzione fresca di 0,74 g. paraformaldeide in 4,0 ml di dH ₂ O e con 28 ml di KOH 1N. Calda a 65 ° C per sciogliere la paraformaldeide e quindi memorizzare su ghiaccio.
2. Fissativo 1. Preparare una soluzione fresca di 0,5 ml di PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml di dH ₂ O e 1,0 ml di uno stock di formaldeide 5X. Caldo per disperdere i Triton X-100 e l'utilizzo entro 1 ora.
3. Fissativo 2. Preparare una soluzione fresca di 1,5 ml di dH ₂ O, 2,5 ml di acido acetico glaciale, e 1,0 ml da uno stock di formaldeide 5X e utilizzare entro 1 ora.
4. Soluzione di acido Lactoacetic. Preparare una soluzione di 1 ml di acido lattico, 2 ml di dH ₂ O, e 3 ml di acido acetico.

4. Polytene cromosoma preparazione di squash:

1. Risciacquare con acqua larve e trasferimento in PBS in un piatto di coltura per la dissezione.
2. Afferrare la punta della bocca ganci con un paio di pinze, tenere il corpo circa 2 / 3 del modo verso il basso con l'altra coppia, e tirare sulla bocca ganci così le ghiandole salivari sono esposti. Separare le ghiandole salivari dal cervello e occhi antennali dischi, e sezionare via il corpo di grasso e qualsiasi altri tessuti associati dalle ghiandole.
3. Aggiungere 200 microlitri di Fissativo 1 al primo pozzo di una diapositiva due depressione bene e 200-300 microlitri di Fissativo da 2 a ben due. Trasferimento di una coppia di ghiandole salivari in un momento di Fissativo 1 nel bene uno e incubare per la quantità di tempo necessario per l'epitopo bersaglio, di solito circa 1-2 minuti. (Nota: alcuni epitopi, come per la maggior parte delle modificazioni degli istoni, può richiedere 5 minuti o più a lungo fissazione.)
4. Pinze utilizzando il trasferimento delle ghiandole salivari di Fissativo 2 in ben 2 e incubare per due minuti.
5. Trasferire le ghiandole a 10-30 ml di soluzione acida Lactoacetic su un vetrino pulito Sigmacoted. Abbassare delicatamente uno polilisina rivestita vetrino da microscopio sul vetrino e, senza applicare pressione verticale, sollevare il vetrino così le ghiandole sono tra il vetrino ed il coprioggetto. Immediatamente facilitare la lisi cellulare e cromosomiche diffondere con attenzione afferrando il vetrino con una pinza su un lato delicatamente e spostando leggermente avanti e indietro, cercando di minimizzare qualsiasi pressione verticale sul tessuto. In alternativa, utilizzare il lato gomma di una matita o anche un dito per spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro. Si noti che qualsiasi ritardo nello spostamento del coprioggetto avanti e indietro è probabile che a diminuire la diffusione delle braccia cromosomiche come tenderanno a diventare più rigida su esposizione alla soluzione di acido Lactoacetic. Intorbidimento della soluzione è spesso una buona indicazione di separazione delle cellule. Picchiettando leggermente sulla coprioggetto obliquamente (per evitare una pressione verticale) con il lato gomma di una matita un paio di volte può anche aiutare nella diffusione dei cromosomi.
6. Immediatamente esaminare il tessuto al microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 20 o 40X per determinare se i cromosomi sono ben diffuse.
7. Quando il cromosomico diffusione è sufficiente impostare la diapositiva con il lato coprioggetti in giù su una pila di pulizia Kim-salviette. Posto un secondo Kim-wipe sulla parte superiore e appiattire cromosomi, ponendo il pollice su dove è posizionato il coprioggetto e premendo con decisione, evitando qualsiasi movimento orizzontale del vetrino che al taglioi cromosomi.
8. Esaminare il vetrino di nuovo sotto il microscopio per determinare se il preparato è adatto per lo scopo previsto. Se i cromosomi sono mossi in maniera significativa su schiacciamento, l'uso meno volume di soluzione acida Lactoacetic nella vostra preparazione successive. Ripetere i passaggi 4,1-4,8 fino a quando un numero sufficiente di diapositive adatte sono stati ottenuti. Mettere 175 g di peso sul vetrino delle diapositive.
9. Riempire un piccolo Dewar (ad esempio, thermos) con azoto liquido. Utilizzando una pinza lunga, tuffo scivolare in N ₂ liquido fino a quando la smette di ebollizione, togliere diapositiva e utilizzare immediatamente il bordo di una lama di rasoio pulito in un angolo a buttar via il coprioggetto. Se diapositive sarà utilizzato immediatamente, mettere in una vaschetta Coplin con PBS a 4 ° C. Mettere insieme il vetrino in una vaschetta Coplin pieno di etanolo al 95%. Esaminare il vetrino una volta che il gelo ha sublimato via per confermare che il tessuto aderito alla diapositiva e non rimanere con il coprioggetto. Ripetete con il resto delle diapositive fino a quando tutte le diapositive vengono memorizzati in PBS (per l'uso entro alcune ore) o etanolo (per la conservazione a lungo termine).

Rappresentante Risultati

Il primo passo fondamentale per l'ottenimento di alta qualità polytene preparazione zucca è di far crescere le larve di grasso con grandi nuclei delle ghiandole salivari. Il secondo è una buona tecnica con la procedura di diffusione, che può richiedere una certa pratica. Un consiglio per una migliore diffusione successo è quello di trovare il volume minimo di soluzione di acido lactoacetic durante la fase di schiacciamento. Ciò promuoverà sufficiente diffusione dei cromosomi senza generare eccessive forze di streaming in grado di lavare via le armi dei cromosomi. E 'anche opportuno ricordare che i ritardi nello spostamento del coprioggetto avanti e indietro riduce la diffusione delle braccia cromosomiche man mano che diventano più rigidi quando sono esposti alla soluzione acida Lactoacetic.

Se tutto va bene, ci dovrebbe essere numerosi cromosomi ben distribuiti politenici. La Figura 1 mostra un esempio di una tale preparazione, doppie etichettato con un marcatore per le regioni interbanda in verde e con un colorante che macchia le regioni a bande di colore blu. Se insufficiente diffusione è ottenuto, i cromosomi sarà simile a palline, come mostrato nella Figura 2. D'altra parte, se troppo diffusione si è verificata, il chomosomes sarà troppo sottile e prolungato o in alcuni casi frammentato in piccoli pezzi, come mostrato nella Figura 3.

Figura 1. Preparazione zucca polytene doppio etichettati con anticorpi al JIL-1 istone H3S10 chinasi (in rosso) e Hoechst (blu).

Figura 2. Zucca politene con diffusione insufficiente.

Figura 3. Zucca politene con troppa diffusione.

Discussion

L'inclusione degli acidi acetico e lattico in protocolli convenzionali fissazione da squash facilita sia la risoluzione interbanda e braccio cromosomico diffusione ma purtroppo alcuni epitopi non sopravvivono a questo trattamento. Un esempio di tale epitopo è H3S10ph (Cai et al., 2008). Poiché il trattamento acido ha anche lo svantaggio che disseta la fluorescenza intrinseca di proteine ​​GFP-tagged, DiMario et al. (2006) ha recentemente sviluppato una base di formaldeide "acid-free tecnica di zucca" che permettono per la visualizzazione diretta della proteina di fusione GFP-su cromosomi politenici senza GFP-anticorpo di etichettatura, nonché per la rilevazione di anticorpi di acido-sensibili epitopi. Le modifiche di questa procedura sono descritte in dettaglio nel Johansen et al. (2009). Un rappresentante preparazione acido fisso da squash polytene doppio etichettati con anticorpi al JIL-1 istone H3S10 chinasi e Hoechst è mostrato in fig. 1.