De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Summary

Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium voor te bereiden

Abstract

Drosophila is al lang een favoriet modelsysteem voor het bestuderen van de relatie tussen de structuur van chromatine en genregulatie als gevolg van de cytologische voordelen die door de reus speekselklieren polytheen chromosomen van de derde instar larven. In dit weefsel worden de chromosomen ondergaan vele ronden van replicatie in de afwezigheid van celdeling die aanleiding geven tot ongeveer 1000 exemplaren. Het DNA blijft uitgelijnd na elke replicatieve cyclus resulteert in sterk vergroot chromosomen die een unieke kans om chromatine morfologie correleren met de lokalisatie van specifieke eiwitten te verstrekken. Bijgevolg is er een hoge mate van interesse in het definiëren van de epigenetische modificaties aanwezig op verschillende genen en in verschillende stadia van het transcriptie proces. Een belangrijk instrument voor een dergelijk onderzoek is de etikettering van polytheen chromosomen met antistoffen tegen het enzym, transcriptie factor, of histon-eiwitten van belang. Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium om Drosophila polytheen chromosomen voor te bereiden voor antilichaam labeling.

Protocol

Het volgende protocol voor polytheen chromosoom squash voorbereiding is een bewerking van de procedure beschreven in Johansen et al.. (2009).

1. Cultuur van de derde instar Drosophila larven

Met het oog op een optimale polytheen chromosomen voor hoge kwaliteit squash voorbereidingen te verkrijgen, uncrowded kweekomstandigheden zijn essentieel (dat wil zeggen, plaats rond 20 eierleggende vrouwtjes in een standaard 4 "fly fles en veranderen in een nieuwe fles per dag). Selecteer de dikste individuen van de eerste oogst van het klimmen 3e instar larven, terwijl ze nog steeds zwerven, maar vlak voor het verpoppen. We routinematig cultuur bij 21 ° C, maar 18 ° C zal opleveren dikker chromosomen die meer geschikt zijn voor bepaalde doeleinden, zoals bijvoorbeeld zijn wanneer band / interband regio's moeten worden gevisualiseerd met een hoge resolutie.

2. Polytheen squash materialen

• Drummond dissectie pincet (2)
• Petrischalen (60 x 15 mm)
• Frosted objectglaasjes (Fisher No 12-544-3) (poly-lysine-coated)
• 22 x 22 mm nr. 15 dekglaasjes (Fisher nr. 12-520B) (gecoat met Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm nr. 15 dekglaasjes (Fisher nr. 12-530B)
• Kim-doekjes
• Fase contrast microscoop met 20X doel
• Kleine Dewar (bijv. thermoskan of thermos fles)
• Lange pincet
• Scheermesjes
• Coplin Jar
• Rubber-Maid of Tupperware lade (of gelijkwaardig afsluitbare lade)
• Parafilm (gesneden in 22 mm vierkantjes)
• 175 g gewichten

3. Fixeermiddelen en oplossingen

1. 5x formaldehyde voorraad. Bereid een verse oplossing van 0,74 g paraformaldehyde in 4,0 ml van dH ₂ O en met 28 ul van 1N KOH. Warm tot 65 ° C om de paraformaldehyde op te lossen en vervolgens op te slaan op ijs.
2. Fixeermiddel 1. Bereid een verse oplossing van 0,5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O en 1,0 ml van een 5x formaldehyde voorraad. Warm aan de Triton X-100 te verspreiden en binnen een uur te gebruiken.
3. Fixatief 2. Bereid een verse oplossing van 1,5 ml dH ₂ O, 2,5 ml ijsazijn en 1,0 ml van een formaldehyde 5X voorraad en binnen 1 uur.
4. Lactoacetic zure oplossing. Bereid een oplossing van 1 ml melkzuur, 2 ml dH ₂ O, en 3 ml azijnzuur.

4. Polytheen chromosoom squash voorbereiding:

1. Spoel larven met water en over te dragen aan PBS in een weefselkweek schotel voor dissectie.
2. Pak het uiteinde van de mond haken met een pincet, houdt het lichaam ongeveer 2 / 3 van de weg naar beneden met het andere paar, en trek op de mond haken, zodat de speekselklieren worden blootgesteld. Scheiden de speekselklieren van de hersenen en in het oog antennale schijven, en ontleden weg het vet het lichaam en alle andere omliggende weefsels van de klieren.
3. Voeg 200 microliter van Fixatief 1 tot en met het eerste putje van een twee goed depressie slide en 200 tot 300 microliter van Fixatief 2 tot en met goed twee. Overdracht een paar speekselklieren op een tijd om Fixatief een in goed een en incubeer gedurende de hoeveelheid tijd die nodig is voor de doel-epitoop, meestal ongeveer 1-2 minuten. (Let op: sommige epitopen, zoals voor de meeste van de histon modificaties, kan 5 minuten of langer fixatie.)
4. Met behulp van een tang overdracht van de speekselklieren te Fixatief twee in goed twee en incubeer gedurende twee minuten.
5. Breng de klieren om 10 tot 30 ul van Lactoacetic zure oplossing op een schone Sigmacoted dekglaasje aan. Voorzichtig zakken een polylysine-coated microscoopglaasje op het dekglaasje en, zonder toepassing van verticale druk, pak het dekglaasje, zodat de klieren zijn tussen de glijbaan en het dekglaasje. Onmiddellijk cel lysis en chromosomale verspreiden vergemakkelijken door voorzichtig vast te pakken de dekglaasje met een tang op een rand en voorzichtig te bewegen een beetje heen en weer, proberen om elke verticale druk op het weefsel te minimaliseren. U kunt ook gebruik maken van de gum kant van een potlood of zelfs een vingertop om voorzichtig te verplaatsen van de dekglaasje heen en weer. Merk op dat elke vertraging bij het bewegen van de dekglaasje heen en weer zal waarschijnlijk afnemen verspreiding van de chromosomale armen zullen ze de neiging om meer rigide geworden na blootstelling aan de Lactoacetic zure oplossing. Vertroebeling van de oplossing is vaak een goede indicatie van de cel scheiding. Voorzichtig tikken op de dekglaasje schuin (de verticale druk te vermijden) met de gum kant van een potlood een paar keer kan ook helpen bij het chromosomale verspreiden.
6. Die onverwijld onderzoekt het weefsel onder een fase contrast microscoop met een 20 of 40X doel om te bepalen of de chromosomen zijn goed verspreid.
7. Wanneer de chromosomale spreiding voldoende is, de schuif naar beneden ingesteld met het dekglaasje kant op een stapel schone Kim-doekjes. Plaats een tweede Kim-wipe aan de bovenkant en plat chromosomen door het plaatsen van uw duim over waar het dekglaasje is geplaatst en stevig op te drukken, het vermijden van een horizontale beweging van het dekglaasje dat zou shearde chromosomen.
8. Onderzoek de schuif opnieuw onder de microscoop om te bepalen of het preparaat geschikt is voor het beoogde doel. Als chromosomen hebben een heel eind op kneuzingen, gebruik minder volume van Lactoacetic zure oplossing in uw verdere voorbereidingen. Herhaal de stappen 4.1-4.8 totdat een voldoende aantal geschikte dia's zijn verkregen. Plaats 175 g gewichten op het dekglaasje van de dia's.
9. Vul een klein Dewar (bijv. thermosfles fles) met vloeibare stikstof. Met behulp van een lange tang, dip glijden in vloeibare N ₂ totdat het koken stopt, verwijder glijbaan, en onmiddellijk de rand van een schoon scheermesje gebruiken op de ene hoek naar flip-off van de dekglaasje aan. Als slide zal onmiddellijk worden gebruikt, in een Coplin pot met PBS bij 4 ° C. Anders verzamel de dia in een Coplin pot gevuld met 95% ethanol. Onderzoek de dekglaasje zodra de vorst is weg gesublimeerde om te bevestigen dat het weefsel gehandeld op grond van de dia en niet blijven bij de dekglaasje aan. Herhaal dit met de rest van de dia's totdat alle dia's worden opgeslagen in PBS (voor gebruik binnen enkele uren) of ethanol (voor langere termijn opslag).

Representatieve resultaten

De eerste kritieke stap voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit polytheen squash voorbereiding is om vet larven groeien met grote speekselklier kernen. De tweede is een goede techniek met de verspreiding procedure, die enige oefening kan nemen. Een tip voor een betere verspreiding van het succes is de minimale volume van de lactoacetic zure oplossing te vinden tijdens het pletten stap. Dit zal de voldoende spreiding van de chromosomen, zonder buitensporig hoge streaming krachten die weg kan wassen chromosoom armen. Het is ook vermeldenswaard dat elke vertraging bij het verplaatsen van het dekglaasje heen en weer zullen verminderen verspreiding van de chromosomale armen naarmate ze meer rigide bij blootstelling aan de Lactoacetic zure oplossing.

Als alles goed gaat, moet er worden tal van goed verdeeld polytheen chromosomen. Figuur 1 toont een voorbeeld van een dergelijke voorbereiding, dubbele gelabeld met een marker voor interband regio's in het groen en met een kleurstof die vlekken de gestreepte regio's in het blauw. Als er onvoldoende spreiding wordt verkregen, zal de chromosomen zien eruit als kleine bolletjes, zoals weergegeven in figuur 2. Aan de andere kant, als er teveel verspreiden zich heeft voorgedaan, zal de chomosomes te dun en uitgebreid of in sommige gevallen versnipperd in kleine stukjes, zoals aangegeven in figuur 3.

Figuur 1. Polytheen squash voorbereiding dubbel gelabeld met antilichaam tegen de JIL-een histon H3S10 kinase (in rood) en Hoechst (blauw).

Figuur 2. Polytheen squash met onvoldoende verspreiden.

Figuur 3. Polytheen squash met te veel verspreiden.

Discussion

De opname van azijnzuur en melkzuur in de conventionele squash fixatie-protocollen faciliteert zowel interband resolutie en chromosomale arm verspreiden, maar helaas sommige epitopen niet overleven deze behandeling. Een voorbeeld van een dergelijke epitoop is H3S10ph (Cai et al.., 2008). Omdat behandeling met zuur heeft ook het nadeel dat het de inherente fluorescentie van GFP-gemerkte eiwitten, Dimario et al. lest. (2006) recent ontwikkelde een formaldehyde-based "zuurvrij squash techniek" die voor de directe visualisatie van GFP-fusie-eiwit op polytheen chromosomen mogelijk te maken zonder GFP-antilichaam etikettering, alsmede voor de opsporing van antilichamen van zuur-gevoelige epitopen. De wijzigingen voor deze procedure worden verder in detail beschreven in Johansen et al.. (2009). Een vertegenwoordiger zuur vast polytheen squash voorbereiding dubbel gelabeld met antilichaam tegen de JIL-een histon H3S10 kinase en Hoechst wordt getoond in Fig. 1.