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Biology

प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला Explants से विकसित कोशिकाओं

doi: 10.3791/1789 Published: March 26, 2010

Summary

यहाँ हम मानव ब्रोन्कियल airway ऊतक के एक हवा तरल इंटरफेस पर विभेदित विकास सहित explants से प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं से बढ़ के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन. इस विधि मानव फेफड़े के स्वास्थ्य और रोग में airway उपकला की भूमिका की जांच के लिए एक प्राथमिक कोशिकाओं के प्रचुर स्रोत प्रदान करता है.

Protocol

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मानव ब्रोन्कियल खंड प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का एक प्रचुर स्रोत प्रदान करते हैं. इस अनुच्छेद में हम विकास और हौसले से अलग मानव ब्रोन्कियल क्षेत्रों से मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (HbE) के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल पांच वर्गों के होते हैं:

  1. कोटिंग और 100mm संस्कृति प्लेट्स Scratching
  2. ब्रोन्कियल ऊतक Explants तैयारी
  3. ब्रोन्कियल ऊतक प्रत्यारोपण
  4. HbE कक्ष के पारित होने
  5. बढ़ते Transwells पर रोमक HbE कक्ष

इससे पहले कि आप ध्यान दें कि सभी चरणों जब तक अन्यथा कहा जैविक सुरक्षा (बीएससी) मंत्रिमंडल में किया जाता है शुरू करते हैं. कृपया सुनिश्चित करें कि आप सभी इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री है. सामग्री, अभिकर्मकों और तैयारी अनुभाग पढ़ सकते हैं और सुनिश्चित करें कि आप aseptically (यानी में एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या BSC) निम्न तैयार करें:
कोटिंग शेयर समाधान: (10 μg / एमएल) fibronectin, (10 μg / एमएल) BSA और कोलेजन (30 μg / मिलीलीटर) Earle बैलेंस्ड नमक समाधान में (EBSS, बाँझ).
संस्कृति मध्यम: DMEM / हाम additives, एंटीबायोटिक antimycotic (1%) और FBS के साथ F-12 (1% )
हदबंदी समाधान: / trypsin EDTA स्टॉक समाधान और FBS साथ DMEM/F-12 (10%)

1. कोटिंग और 100mm संस्कृति प्लेट्स Scratching: Explants 100mm संस्कृति प्लेटों में चढ़ाया जाएगा. कोटिंग कोटिंग समाधान के साथ 100mm संस्कृति प्लेटों के द्वारा शुरू करो. यह BSC में किया जाना चाहिए, सब कुछ बाँझ रखने.

  1. बाँझ 100mm संस्कृति प्लेटों BSC और कोटिंग समाधान (कोलेजन / fibronectin / BSA) रखें.
  2. एक 100mm थाली में पिपेट 2.0 मिलीलीटर कोटिंग के समाधान.
  3. आसपास भंवर प्लेट के आधार कोट पर. सुनिश्चित करें कि कोटिंग समाधान प्लेट के आधार समान रूप से शामिल किया गया.
  4. बचे हुए समाधान पिपेट से बाहर है और यह एक दूसरा 100mm थाली कोट का उपयोग करने के लिए. के रूप में कई प्लेटों के रूप में की जरूरत के लिए दोहराएँ. जरूरत प्लेटों की संख्या ऊतक explants की संख्या के साथ बदलता रहता है.
  5. सुनिश्चित करें कि कोटिंग समाधान में समान रूप से के रूप में प्रदर्शन प्लेटों के ठिकानों शामिल है.
  6. उनके कवर के साथ कवर प्लेटें. प्लेटें इनक्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए सूखी करने के लिए और ब्रोन्कियल ऊतक explants के लिए उपयोग करने से पहले अतिरिक्त समाधान aspirate दें. अप्रयुक्त लेपित संस्कृति प्लेटें एक बाँझ बैग में रखा जा सकता है, सील और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस (बाद में उपयोग के लिए फ्रिज में एक महीने के लिए संग्रहीत कर सकते हैं). उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को लाओ.
  7. स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ छोटे तेज कैंची, स्केलपेल, और संदंश स्वच्छ और BSC में लाना. स्केलपेल के साथ मजबूती से दबाने गहरी छोटे एक्स (कम से कम 4) फार्म द्वारा लेपित प्लेटें स्क्रैच. यदि खरोंच काफी गहरी नहीं है, ऊतक टुकड़े लकीरें में समझौता नहीं होगा और फ्लोट जाएगा.

2. ब्रोन्कियल ऊतक Explants तैयारी

ब्रोन्कियल सर्जरी के बाद 24-36 घंटे के भीतर प्राप्त ऊतक का उपयोग करें. EBSS में बर्फ पर ऊतक रखें उपयोग के लिए तैयार है जब तक.

  1. BSC बाहर: एक पेट्री डिश में रखें ऊतक. EBSS में पृथक मानव ब्रोन्कियल ऊतक नमूनों को अच्छी तरह कुल्ला.
  2. अतिरिक्त आसपास के ऊतकों काटना.
  3. खोलने के ब्रोन्कियल टुकड़े काटें.
  4. BSC और हस्तांतरण में एक बाँझ DMEM/HamF12 ठंड के साथ 100mm टिशू कल्चर थाली में ऊतक लाओ + 1% / एंटीबायोटिक antimycotic .
  5. तेज छोटे कैंची का उपयोग करने के लिए 2-3 मिमी 3 टुकड़ों में ऊतक में कटौती.
  6. प्लेस प्रत्येक एक्स के केंद्र में कटौती ऊतक के एक संदंश और प्रेस धीरे के साथ टुकड़ा.
  7. चलो ऊतक टुकड़े (explants) कुछ ही सेकंड के लिए थाली का पालन करने के लिए, और फिर धीरे पूरा मीडिया के 10ml (DMEM/HamF12 + additives 1% एंटीबायोटिक antimycotic / + 1% FBS) जोड़ने. यदि ऊतक मीडिया जोड़ने के बाद तैरता, संदंश का उपयोग करने के लिए एक्स की लकीरें में ऊतकों को धक्का या एक नई एक्स बनाने के लिए यह नई एक्स बनाने के लिए आवश्यक हो सकता है अगर लकीरें गहरी पर्याप्त नहीं हो सकता है.
  8. इनक्यूबेटर परिवर्तन और मीडिया में हर 3-4 दिनों प्लेस प्लेटें.
  9. ऊतकों प्रत्यारोपण जब पर्याप्त उपकला कोशिकाओं ऊतक explants के आसपास हो गए हैं 1-2cm क्षेत्रों को कवर करने के लिए तैयार हैं. यह लगभग 4 सप्ताह लगते हैं.

3. ब्रोन्कियल ऊतक प्रत्यारोपण

  1. 100mm लेपित और खरोंच प्लेटों का उपयोग करें. के बाद से कुछ ऊतक explants सफल नहीं हो सकता है, प्लेटों की संख्या आप कैसे कई ऊतक के टुकड़े रोपाई कर रहे हैं पर निर्भर करता है. यदि आप प्लेटें कि पहले लेपित किया गया है और संग्रहीत 4 बजे ° सी का उपयोग कर रहे हैं, प्रयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर लाने के.
  2. संदंश का प्रयोग, ध्यान से मूल और एक्स के नए थाली में केंद्र में थाली जगह से ऊतक लेने, और धीरे दबाएँ. कोई परिणाम के साथ ऊतकों को खारिज किया जाना चाहिए.
  3. चलो ऊतक कुछ सेकंड के लिए थाली करने के लिए पालन, मीडिया जोड़ सकते हैं और के रूप में वर्णित कान सेतेexplants (2.7-2.9) के लिए Lier.

4. मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (HbE) के पारित होने

  1. प्रत्येक 100mm टिशू कल्चर की थाली के लिए / trypsin EDTA स्टॉक समाधान के 2ml पहले गला लें. बाँझ 0.01M पीबीएस के 6ml के साथ शेयर पतला (यानी 6 मिलीलीटर पीबीएस (trypsin के अंतिम एकाग्रता के लिए 2 मिलीलीटर शेयर समाधान जोड़ने के 250 μg / मिलीलीटर है और EDTA के लिए 100 μg / एमएल).
  2. एक नई प्लेट explants जाने के बाद, कक्षों की 1-2cm के छल्ले के साथ प्लेटों से मीडिया aspirate.
  3. प्रत्येक 100mm थाली और इनक्यूबेटर में जगह (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए 3-15 मिनट के लिए गर्म पतला समाधान / trypsin EDTA के 8ml जोड़ें. अक्सर जाँच करें, पर भी लंबे समय से कोशिकाओं को नुकसान होगा trypsin छोड़ने.
  4. एक खुर्दबीन के नीचे प्लेटों की जाँच करें सुनिश्चित करें कि कक्षों की सबसे उठाया गया है. कक्ष दौर और अलग रूप में दिखाया गया.
  5. थाली के प्रति मीडिया में गरम 10% FBS 8ml जोड़ें trypsin / EDTA समाधान निष्क्रिय.
  6. एक ट्यूब (या अगर विभिन्न ऊतकों अलग ट्यूब) में सभी प्लेटों के संस्करणों का मिश्रण. एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो.
  7. 5 मिनट के लिए 100g पर अपकेंद्रित्र. एक सेल गोली ट्यूब के आधार पर फार्म जाएगा.
  8. पुनः निलंबित पूरा मीडिया में वांछित कक्ष एकाग्रता के लिए सेल गोली (DMEM / हाम F12 + सभी + 1% एंटीबायोटिक antimycotic additives + 1% FBS).
  9. T75 फ्लास्क प्रति प्रत्येक 2-3 मिलियन कोशिकाओं प्लेस और पूरा मीडिया के रूप में आवश्यक जोड़ें. सेते हैं और मीडिया को बदलने के हर 3-4 हफ्तों. कक्ष के बारे में 4 सप्ताह में T75 बोतल में संगम उप (80-90%) बढ़ने. कोशिकाओं और उठाया जाना चाहिए, विस्तार या उप संगम पर senescence को रोकने के लिए इस्तेमाल किया.

5. Transwells पर रोमक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (HbE) बढ़ रहा है.

प्राथमिक उपकला ऊतक explants / प्रत्यारोपण से विकसित कोशिकाओं, तीन गुना हो विस्तारित कर सकते हैं, और फिर से इस्तेमाल किया. 2 सेमी प्रति 50,000 से 1,00,000 कोशिकाओं के एक बोने घनत्व 1,2 की सिफारिश की है. उच्च घनत्व तेजी से भेदभाव को बढ़ावा देता है.
नोट: कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी और उनकी संख्या को मापने. 2ml प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं पर संस्कृति के माध्यम में पुनः निलंबित.

  1. मध्यम (DMEM / हाम F12) का उपयोग पूर्व के साथ सेल संस्कृति आवेषण पूर्व incubating transwells के पारगम्य झिल्ली की तैयारी के साथ शुरू करो. यह कदम इन संवेदनशील कोशिकाओं के साथ आवश्यक है और सेल लगाव में मदद करेगा.
    1. 6.5 मिमी आवेषण कि 24 ही कई अच्छी तरह प्लेटें में फिट का उपयोग करें.
    2. झिल्ली (के लिए 6.5 मिमी आवेषण उपयोग तल पर शीर्ष पर 0.6ml, 0.1ml) के दोनों पक्षों के माध्यम जोड़ें. सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में 1 घंटे सेते हैं.
    3. ध्यान (aspirate) बेसल मात्रा के साथ पहली बार शुरू झिल्ली के दोनों तरफ से मध्यम हटाने.
      ध्यान का मतलब है: झिल्ली आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है, इसलिए संस्कृति डालने की ओर नीचे मध्यम पिपेट, सिफारिश की मात्रा का उपयोग करें. नहीं तो कर मीडिया के अन्य कुओं को लीक में परिणाम देगा.
  2. पारगम्य समर्थन के पूर्व ऊष्मायन के बाद बीज कक्ष
    1. के लिए 6.5mm कुओं झिल्ली के शिखर की ओर सेल निलंबन की 0.1 मिलीलीटर (यानी 50,000 कोशिकाओं) जोड़: ध्यान से अपने सेल निलंबन पिपेट झिल्ली के शिखर पक्ष में.
    2. पिपेट झिल्ली के बेसल तरफ 0.6ml मध्यम.
  3. 10 दिनों के लिए शिखर और बेसल पक्षों से कोशिकाओं को फ़ीड करने के लिए एक अच्छी तरह से विभेदित संस्कृति स्थापित: दो बार एक सप्ताह प्रदर्शन विधि का उपयोग विनिमय मध्यम:
    1. पहली बार बेसल मात्रा निकालें
    2. शिखर मात्रा (0.1ml मध्यम) बदलें
    3. झिल्ली के बेसल पक्ष के लिए माध्यम की 0.6 मिलीलीटर जोड़ें.

    इस विधि झिल्ली सेल लगाव को बढ़ावा देता है और समय की लंबी अवधि (विनिमय मीडिया जल्दी और इनक्यूबेटर में वापस रख) के लिए हवा के संपर्क में किया जा रहा से कोशिकाओं को रोकता है है.
  4. शिखर मध्यम हटाने द्वारा 10 दिन पर एक एयर तरल इंटरफ़ेस (अली) बनाएँ, तब झिल्ली के बेसल पक्ष पर माध्यम की 0.6 मिलीलीटर की जगह.
  5. अली में 6 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, एक सप्ताह में दो बार मीडिया को बदलने. रोमक कोशिकाओं अली के निर्माण के बाद 4 सप्ताह प्रदर्शित होने शुरू कर देंगे. कक्ष रोमक कोशिकाओं में अली के निर्माण के बाद 6 सप्ताह वर्दी भेदभाव को प्राप्त होगा.

सामग्री तैयार:

1. कोटिंग स्टॉक समाधान की तैयारी (BSC में इस):

प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं fibronectin / BSA / 3 कोलेजन के साथ लेपित सतहों पर अच्छी तरह से जाना. कोटिंग शेयर समाधान explant और प्रत्यारोपण के रूप में ऊपर वर्णित संस्कृतियों के लिए 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेटों के लिए इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा कोटिंग समाधान कोट coverslips के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सेल लगाव गति, coverslips तब प्रयोगों immunostaining के लिए उपयोग कर सकते हो.

  1. Fibronectin (1mg/ml शेयर समाधान): F2006 2mg सिग्मा से प्रयोग करें . 2mls बाँझ Earle संतुलित नमक (EBSS, 28888 सिग्मा) समाधान, जैविक सुरक्षा मंत्रिमंडल (बीएससी) में 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फिल्टर में भंग 2mg. बाद में उपयोग के लिए -20 ° सी फ्रीजर में स्टोर 1ml, और एक 100 mls कोटिंग समाधान की तैयारी के लिए एक मिलीलीटर का उपयोग करें.
  2. BSA (1mg/ml शेयर समाधान): का प्रयोग करें सिग्मा A4919-1g. वजन 20 मिलीग्राम BSA और 20 mls बाँझ EBSS, बीएससी में 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ फिल्टर में भंग. 1ml शीशियों और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर जब तक जरूरत में विभाज्य. कोटिंग समाधान के 100mls बनाने के शेयर की 1ml का प्रयोग करें.
  3. कोलेजन शेयर (0.1% या 1mg/ml से C8919 सिग्मा के रूप में प्रदान की) समाधान नोट: BSC और मुहर तंग में फ्रिज के लिए लौटने से पहले ही खुले . शेयर की 3 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए कोटिंग समाधान के 100 मिलीलीटर के लिए.
  4. BSC में: कोटिंग शेयर समाधान 3mls कोलेजन 1ml (1mg/ml) fibronectin और 1ml BSA (1mg/ml), प्लस 95 mls EBSS (बाँझ) (1mg/ml) जोड़ने. 2 मिलीलीटर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शीशियों और दुकान में और अच्छी तरह से विभाज्य मिक्स जब तक जरूरत है. कोटिंग शेयर समाधान में अंतिम सांद्रता: (10 μg / एमएल) fibronectin, BSA (10 μg / एमएल) और EBSS में कोलेजन (30 μg / मिलीलीटर).

2. संस्कृति (BSC में तैयार) मध्यम तैयार: मध्यम सिग्मा से DMEM / हाम F-12 के गोजातीय पीयूषिका (15 μg / मिलीलीटर) निकालने और अन्य additives के साथ epidermal वृद्धि कारक (10 एनजी / एमएल) के रूप में नीचे संकेत के साथ होते हैं. एंटीबायोटिक antimycotic / (1%) और FBS (1%) हौसले हर समय मध्यम संस्कृति बदल रहा है जुड़ जाते हैं. इस माध्यम के कई तरीके है कि airway उपकला कोशिका 3-9 संस्कृतियों वर्णित की समीक्षा द्वारा संकलित किया गया था. हमारी मध्यम मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का इष्टतम विकास के लिए इरादा है.

  1. गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (BPE 1mg/ml शेयर समाधान): सिग्मा P1476 (14mg/ml बाँझ और फ़िल्टर्ड समाधान में 2.5 मिलीलीटर BPE): पतला शेयर 2.5 के mls 1mg/ml की अंतिम एकाग्रता (14mg/ml). यानी 1mg/ml के एक शेयर के लिए बाँझ EBSS के 32.5 मिलीलीटर के लिए 2.5 मिलीलीटर BPE शेयर जोड़ें. 7.5 मिली aliquots (7.5 मिलीलीटर aliquots के 4 ट्यूबों और 5 मिलीलीटर विभाज्य की एक ट्यूब) में फूट डालो. कमजोर पड़ने के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान aliquots जरूरत जब तक. पुनर्गठन उत्पाद का लम्बे समय तक भंडारण और ठंड और विगलन दोहराया सिफारिश नहीं कर रहे.
  2. Epidermal वृद्धि कारक (EGF 10 शेयर समाधान / μg मिलीलीटर): सिग्मा E9644 0.2mg. Reconstitute 0.2 मिमी की 20 एमएस फ़िल्टर 10 मिमी एसिटिक एसिड में (0.2mg) सामग्री 0.1% युक्त BSA (यानी 10 मिमी एसिटिक एसिड के 20 मिलीलीटर में 20 मिलीग्राम BSA भंग और तब फ़िल्टर reconstitute EGF का उपयोग करने के लिए). 0.5 मिलीलीटर aliquots और -20 फ्रीजर में स्टोर में विभाज्य. 100 मिलीलीटर मीडिया के लिए 100μl का प्रयोग करें.
  3. एपिनेफ्रीन (5mg/ml स्टॉक समाधान): सिग्मा E1635. 2ml 1M फ़िल्टर हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल), 50 μl शीशियों और फ्रीज (-20 ° सी) में विभाज्य में 10mg भंग.
  4. (2mg/ml शेयर समाधान) इंसुलिन: सिग्मा I6634 50mg. 25ml फ़िल्टर (0.2μm फिल्टर) पतला एचसीएल (1mm) में 50mg भंग. 1.25ml शीशियों में विभाज्य.
  5. Tranferrin मानव (50 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान): सिग्मा 100mg T8158. DH20 2ml में 100mg भंग (0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ फ़िल्टर्ड). 100μl प्रत्येक (0.5ml शीशियों में) विभाज्य.
  6. (1mg/ml शेयर समाधान) Triiodo एल - thyronine: सिग्मा 100mg T6397. 100ml 1M फ़िल्टर एचसीएल में 100mg भंग. 1ml aliquots में विभाज्य. 10μl aliquots में विभाज्य 0.5ml.
  7. (5mg/ml शेयर समाधान) Hydorcortisone: सिग्मा H0888 वजन 100mg और 5mg/ml स्टॉक के लिए 20ml फ़िल्टर इथेनॉल में भंग. 1ml शीशियों के लिए विभाज्य. (5mg/ml) 1ml 50μl aliquots (0.5ml शीशियों) फूट डालो.
  8. Retinoic एसिड (1mg/ml शेयर समाधान है, जब इस्तेमाल किया 0.01mg/ml पतला): R2625 100mg सिग्मा) . इथेनॉल के 10ml में 100mg भंग. 1.0ml aliquots के लिए फूट डालो. फूट डालो (1ml) शीशी 20μl प्रत्येक के 50 ट्यूबों के लिए. -20 डिग्री सेल्सियस पर रुक एक 20μl शीशी ले लो और 0.01mg/ml के एक शेयर के लिए मीडिया के साथ 2000μl पतला जब जरूरत.
  9. सिग्मा A8412: गोजातीय सीरम, बाँझ फ़िल्टर, सेल संस्कृति से albumin समाधान का परीक्षण किया. ठंड में स्टोर समाधान (4 डिग्री सेल्सियस) तक की जरूरत है. BSC में ही खोलें.
  10. एंटीबायोटिक Antimycotic, A5955 सिग्मा: 1ml मात्रा -20 डिग्री सेल्सियस जरूरत जब तक विभाज्य और फ्रीज. मध्यम में 1% की अंतिम एकाग्रता में प्रयोग.
  11. FBS, सिग्मा F1015: 50 FBS निष्क्रिय ° C 30 मिनट के लिए. BSC में शांत करने की अनुमति दें. 1ml और 10 मिलीलीटर बाँझ शीशियों में विभाज्य. का प्रयोग करें 1% की संस्कृति के माध्यम में अंतिम एकाग्रता और मीडिया में 10% के अंतिम एकाग्रता में trypsin / EDTA समाधान बेअसर.
  12. मध्यम संस्कृति के संविधान:
    के लिएमध्यम DMEM/HamF12 उपयोग की 500 मिलीलीटर:
    • BPE 1 15μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्यूब (1mg/ml के प्रत्येक 7.5ml).
    • 1 10ng/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए EGF (10μg/ml के 0.5ml) के ट्यूब.
    • एपिनेफ्रीन के 0.5μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 (5mg/ml के 50μl) ट्यूब.
    • इंसुलिन 5μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 (2mg/ml के 1.25ml) शीशी.
    • 10μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 Transferin (50mg/ml के 100μl) की शीशी.
    • Triiodo एल thyronine के 10ng/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 5 (1mg/ml पर) μl.
    • Hydrocortisone 0.5μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 1 (5mg/ml के 50μl) शीशी.
    • Retinoic एसिड की 5 μl 0.1ng/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.01mg/ml को पतला.
    • 1.5μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 10 μl गोजातीय सीरम से albumin समाधान
    जगह एक 500 मिलीलीटर बाँझ बोतल में 7.5 BPE शेयर समाधान के मिलीलीटर, और सभी additives के रूप में ऊपर से जोड़ने. DMEM / हाम F-12 के साथ 500 मिलीलीटर के लिए बनाओ. स्टोर समाधान कस फ्रिज में बंद कर दिया और प्रकाश से बचाने के लिए. जब प्लेटें, केवल विभाज्य राशि की जरूरत में मध्यम जगह और जोड़ ताजा (1%) एंटीबायोटिक antimycotic और FBS (1%), 37 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें तो गर्म की जरूरत है.

3. हदबंदी समाधान की तैयारी:

  1. Trypsin / EDTA स्टॉक समाधान की तैयारी: 500 मिलीलीटर 0.01M पीबीएस (E6758 सिग्मा) में 100mg (सिग्मा T9935-100mg) trypsin और 40mg EDTA (E6758 सिग्मा) को भंग . 2ml शीशियों और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर में विभाज्य. समाधान शेयर पतला: 6 मिलीलीटर पीबीएस (trypsin के अंतिम एकाग्रता 250 / μg मिलीलीटर EDTA के लिए और 100 μg / मिलीलीटर) 2 मिलीलीटर शेयर समाधान जोड़ने.
  2. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए समाधान: ताजा BSC में मीडिया में 10% FBS तैयार: 9 मिलीलीटर मीडिया (DMEM / हाम F-12) के लिए 1 मिलीलीटर FBS जोड़ने. प्रत्येक 100mm थाली के लिए गरम 10% FBS 8 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए हदबंदी समाधान के 8 मिलीलीटर बेअसर.

4. विशेष आवश्यकताएँ:

  1. जब संवर्धन उपकला कोशिकाओं, तुम सब कुछ साफ और कीटाणुरहित रखने की जरूरत है. सभी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों बाँझ या 0.2μm फिल्टर के साथ फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. सामग्री और additives की तैयारी एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (BSC) में किया जाना चाहिए. मीडिया या मीडिया के अलावा बदलने BSC में किया जाना चाहिए.
  2. बाल दूर बाँध, यदि उपलब्ध प्रयोज्य टोपी पहनते हैं, और एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनते हैं.
  3. सब काम अव्यवस्था से मुक्त सतहों रखें. आपरेशन के बीच 70% इथेनॉल के साथ काम की सतहों को साफ और विभिन्न संस्कृतियों से निपटने के बीच 15 मिनट की एक न्यूनतम की अनुमति.
  4. मीडिया के सभी अभिकर्मकों और बोतलें, लेबल, शामिल प्राप्त की गई दिनांक और तैयार तारीख.
  5. सकल बैक्टीरियल या फंगल संदूषण के सबूत के लिए संस्कृतियों और मीडिया नियमित रूप से जांच.
  6. Mycoplasma के लिए नियमित रूप से टेस्ट (यदि आवश्यक)
  7. 37 के लिए डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं पर मीडिया को बदलने से पहले संस्कृति के माध्यम गर्म है.
  8. एंटीबायोटिक्स / antimycotics और FBS हौसले माध्यम से जोड़ा जाना चाहिए.
  9. कम से कम हर 3-4 दिनों के माध्यम बदलें. कोशिकाओं को एक लंबे समय के लिए कमरे के तापमान पर बैठ मत करो. मीडिया को बदलें और तुरंत वापसी के लिए इनक्यूबेटर.

प्रतिनिधि परिणाम:

संस्कृति की विशेषताओं और मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं की आकारिकी

मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं ब्रोन्कियल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्रों, संवर्धन करने के लिए पहले से ब्रश, माइक्रोस्कोपी दोनों रोमक और गैर रोमक उपकला कोशिकाओं के एक सामान्य उपकला (चित्रा 1, 1 अनुपूरक) का संकेत स्ट्रिप्स प्रदर्शन किया . पता चला coverslips पर वरीयता प्राप्त explants और कोशिकाओं से कोशिकाओं के cytospin तैयारी के Immunostaining कि सभी कोशिकाओं उपकला विशिष्ट cytokeratins (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक थे . ब्रोन्कियल ऊतक के explants से सफल संस्कृतियों 8 9 ऊतकों के बाहर में हुई है, के रूप में एक explant संस्कृतियों के संक्रमित हो गया. उपकला कोशिकाओं के छल्ले 3-4 सप्ताह में 1-2 सेमी त्रिज्या (2a चित्रा) पर पहुंच गया. 6 बार अप करने के लिए सफल explants फिर सुसंस्कृत थे. सभी सफल संस्कृतियों में, वहाँ सेल प्रवास के प्रत्यारोपण (चित्रा 2b) शुरू करने के 48 घंटे के भीतर सबूत था . कक्ष एक cobblestone उपस्थिति है कि इन उपकला कोशिकाओं के रूप में 2 आंकड़े, 4, 5 और 6 में दिखाया गया है के लिए अलग है. उप - सुसंस्कृत ब्रोन्कियल कोशिकाओं cytokeratin और ई cadherin के लिए एक समान सकारात्मक immunostaining दिखाया. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के खिलाफ विशेष एंटीबॉडी के साथ Immunostaining fibroblasts द्वारा संस्कृतियों के संक्रमण के कोई संकेत नहीं दिखा था, mesenchymal, या endothelial कोशिकाओं (α-SMA, vimentin, और CD31: दाग PECAM-1 क्रमशः) (चित्रा 5) . एयर तरल रोमक उपकला में विभेदित चित्रा 6 में प्रदर्शन के रूप में इंटरफ़ेस के साथ पारगम्य पॉलिएस्टर झिल्ली (transwells) पर संवर्धित कोशिकाओं. Transwells पर बड़े ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के प्रतिनिधि वीडियो रिकॉर्डिंग cilia (2 अनुपूरक) की धड़कन के साथ एक विभेदित उपकला प्रदर्शित करता है.

मानव ब्रोन्कियल उपकला सेल संस्कृतियों परीक्षण के लक्षण तालिका 1 में दिखाया गया है. पहले बीतने (P1) के लिए औसत समय 4 सप्ताह था, और मतलब उपज 15.1 था ± 2,75 मिलियन कोशिकाओं (n = 9 ऊतकों). explants से P1 पर कोशिकाओं की व्यवहार्यता trypan नीले अपवर्जन द्वारा मूल्यांकन किया गया था, और लगातार इन ब्रोन्कियल संस्कृतियों में उच्च (99%) था. प्रत्येक ऊतक से explant संस्कृतियों से उप - संवर्धित कोशिकाओं बाद में उपयोग के लिए पहले पारित होने के बाद जमा किए गए थे. मतलब सेल explants से बरामद संख्या काफी बाद में पारित संस्कृति से अधिक था (P1 से हर 2 मिलियन कोशिकाओं P2 झुकेंगे: 6.75 ± 2.4 मिलियन कोशिकाओं, n = 5 ऊतकों). One P2 संस्कृति के रूप में morphology उपकला कोशिकाओं (चित्रा 7a) की ठेठ नहीं था खारिज कर दिया था. इसी प्रकार, विभिन्न ऊतकों (चित्रा 7b) की दो अन्य मार्ग (P2 और P3) निकाल दिया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1 मानव ब्रोन्कियल ऊतक क्षेत्रों और रोमक और गैर रोमक कोशिकाओं के एक हौसले से अलग उपकला पट्टी. (क) मानव ब्रोन्कियल ऊतकों के क्षेत्रों के प्रतिनिधि चित्र - ~ 1-2cm लंबी और 1cm <व्यास मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों के लिए प्रयोग किया जाता है. (ख) ब्रोन्कियल खंड से धकेल दिया मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं की एक स्ट्रिप दोनों रोमक और गैर रोमक उपकला कोशिकाओं, बढ़ाई 320X को दर्शाता है. वीडियो cilia की धड़कन के साथ कोशिकाओं के एक अनुपूरक के रूप में प्रदान की जाती है.

चित्रा 2
2 मानव ब्रोन्कियल उपकला कक्ष चित्रा 100mm टिशू कल्चर प्लेटों पर explants से हो. एक) 2 - 3mm3 ऊतक के साथ 100mm थाली. नोट के बारे में 1-2cm की कोशिकाओं की अंगूठी है जो 3-4 सप्ताह के बाद नग्न आंखों को दिखाई हो जाता है. ख) explant ऊतक और उपकला कोशिकाओं के किनारे की छवि के रूप में वे explant, पट्टी = 100μm से विस्थापित. Explants एक नई प्लेट प्रत्यारोपण बन करने के लिए हस्तांतरित. Explants 6 बार प्रतिरोपित कर सकते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 उपकला विशेष cytokeratins के लिए दाग explants से विकसित कोशिकाओं. Explants से कक्ष के Cytospins cytokeratins (हरा) के लिए मोनोक्लोनल विरोधी पान Cytokeratin (मिश्रण) FITC जो मानव cytokeratins 1, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18, और 19 पहचानता साथ दाग रहे थे. नाभिक Hoechst के साथ दाग थे दाग (नीला). मर्ज किए गए छवि यह दर्शाता है कि ब्रोन्कियल explants से विकसित कोशिकाओं मुख्य रूप से थे उपकला कोशिकाओं, बार = 20μm.

चित्रा 4
चित्रा 4 मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के उप - संस्कृति. / trypsin EDTA का प्रयोग), explants और प्रत्यारोपण से कोशिकाओं 100mm प्लेटों से उठा रहे हैं, गिना और T75 फ्लास्क प्रति 2-3 मिलियन कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त. कक्ष (80-90%) के 28-30 दिनों में T75 बोतल में उप संगम (ख, ग) बढ़ता है. नोट उपकला कोशिकाओं के विशिष्ट cobblestone आकारिकी, बार = 100μm.

चित्रा 5
चित्रा 5 उप - संवर्धित ब्रोन्कियल कोशिकाओं उपकला का उपयोग immunostaining के रूप में सत्यापित किया गया. इन कोशिकाओं को सकारात्मक Cytokeratin - (क, ख) FITC, A549 उपकला कोशिकाओं (ग) और एक नकारात्मक नियंत्रण fibroblasts (घ) में प्रदर्शन किया है में दिखाया गया है है cytokeratin - FITC के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए (हरा) दाग. संवर्धित कोशिकाओं ब्रोन्कियल सकारात्मक दाग (गहरे लाल) E-Cadherin/Alexa Fluor 594 (i, j) के लिए, और α-- cy3 SMA (ई, च) (/ Vimentin TRITC (मीटर), और न ही CD31 PECAM के लिए दाग नहीं -1/FITC) (ओ) प्राथमिक चिकनी पेशी, mesenchymal, या endothelial कोशिकाओं क्रमशः के साथ सुसंस्कृत ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का कोई संदूषण का संकेत है. E-Cadherin/Alexa Fluor 594 के लिए सकारात्मक (गहरे लाल) नियंत्रण A549 उपकला कोशिकाओं (कश्मीर) पर प्रदर्शन किया है. Α-SMA-cy3 (लाल) के लिए सकारात्मक नियंत्रण fibroblasts में प्रदर्शन किया है (छ, ज). खरगोश विरोधी माउस TRITC (एन) और गधा विरोधी बकरी FITC (पी), माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण Alexa Fluor 594 (एल) के लिए ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं में दिखाए जाते हैं. बार = 20μm.

चित्रा 6
6 मानव ब्रोन्कियल उपकला transwells पर संवर्धित कोशिकाओं चित्रा. रोमक कोशिकाओं पारगम्य पॉलिएस्टर झिल्ली (6.5mm व्यास) पर 50,000 cel के एक बोने घनत्व संवर्धित कर रहे हैंलोकसभा के प्रति में अच्छी तरह से (एक) = 100μm बार. Cytokeratin (हरा) FITC और DAPI के साथ transwells पर संवर्धित कोशिकाओं का Immunostaining (नीला) दर्शाता है कि इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं, बार = 20μm हैं. कक्ष 10 दिनों के लिए मीडिया में डूबे हुए, तो केवल एक और 4-6 सप्ताह के लिए नीचे से खिलाया मीडिया के लिए एक अली बनाने जब तक cilia के रूप में दिखाया गया है (ख), बढ़ाई 160x में बड़े हो रहे हैं सुसंस्कृत हैं. देखो cilia पिटाई की वीडियो के लिए 2 अनुपूरक . (ग) मंदिर छवियों 6 सप्ताह में cilia अली संस्कृतियों के विकास का प्रदर्शन, बढ़ाई = 150000x.

7 चित्रा
कोशिकाओं है कि आकारिकी के आधार पर त्याग किया जाना चाहिए उदाहरण 7 चित्रा . इन कोशिकाओं को आमतौर पर दिखाई देते हैं जब ऊतक कई बार प्रत्यारोपित किया गया है. ध्यान दें कि दोनों कोशिकाओं और प्रत्यारोपण त्याग किया जाना चाहिए. ) एक कक्ष प्रत्यारोपण है कि 6 बार सुसंस्कृत थे और एक T75 फ्लास्क में मढ़वाया के साथ एक थाली से एकत्र किए गए थे. 1 सप्ताह के भीतर कोशिकाओं एक विशिष्ट आकारिकी से पता चला है कि उपकला कोशिकाओं के cobblestone उपस्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते. इसके बजाय, पतली लम्बी कोशिकाओं घनी बढ़ रहे थे. ख) कोशिकाओं है कि ठेठ उपकला कोशिकाओं के साथ जमा नहीं करना चाहिए और उदाहरण है, लेकिन त्याग किया जाना चाहिए. बार = 100μm.

तालिका 1: मानव ब्रोन्कियल उपकला सेल संस्कृतियों के अभिलक्षण

(ऊतकों #) सफलता दर 8 / 9 (88.8%)
P1 के लिए माध्य समय (रेंज) (सप्ताह) 4 (3-5)
SEM) (सेल कोई मतलब. P1 पर 15.1 (2.75) 10 x 6
P1 पर व्यवहार्यता (SEM) मतलब 99% (2%)
(P1 = पहली बीतने)

1 अनुपूरक रोमक और गैर - रोमक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं एक मानव ब्रोन्कियल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया खंड से ब्रश की एक स्ट्रिप से पता चलता है , बढ़ाई 320X. अनुपूरक 1 वीडियो के लिए यहां क्लिक करें.

2 विभेदित ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं हवा तरल एक अंतरफलक पर हो अनुपूरक. वीडियो (2a और 2b) cilia, बढ़ाई 160X और 320X क्रमशः पिटाई दिखाते हैं. अनुपूरक 2A वीडियो के लिए यहां क्लिक करें . अनुपूरक 2B वीडियो के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

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इस अध्ययन में हम संस्कृति और प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के विस्तार के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत किया. हम दिखा दिया कैसे explants और ब्रोन्कियल ऊतक, मीडिया जो उपकला सेल के विकास को बढ़ावा देने में सुसंस्कृत, प्रत्यारोपण गैर विभेदित (जलमग्न) और विभेदित सेल (हवा तरल इंटरफेस पर हो) मॉडल के अध्ययन के लिए एक मानव airway उपकला कोशिकाओं के सतत स्रोत प्रदान कर सकते हैं . इन कोशिकाओं को दवा परीक्षण प्रणाली में उपयोग किया जा सकता है कि और अधिक बारीकी से उनके वास्तविक शारीरिक वातावरण में कोशिकाओं सदृश. यह बहुत महत्वपूर्ण है कि आप कोशिकाओं है कि explants / प्रत्यारोपण से बढ़ने और cobblestone आकारिकी की पुष्टि घड़ी. यदि कोशिकाओं को एक अलग आकारिकी दिखाने के लिए, दोनों कोशिकाओं और explants / प्रत्यारोपण त्यागें, और सफल ऊतकों केवल रोपाई जारी है. अली संस्कृतियों में हमारे हाथ अब ले लिया करने के लिए स्थापित किया जा से अधिक 2 पहले से सूचना दी . यह संभव है कि मीडिया को हर दूसरे दिन बदल अली पर तेजी से उपकला सेल भेदभाव और cilia के विकास को बढ़ावा देने के सकता है.

हमें उम्मीद है कि यहाँ वर्णित विधियों आप संस्कृति explants से मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के लिए प्रोत्साहित करते हैं और अपने अध्ययन प्रणालियों में इन कोशिकाओं का उपयोग करेगा. सब के बाद, मानव सेल आधारित अध्ययन मानव फेफड़ों की बीमारी तंत्र के महत्वपूर्ण रास्ते का निर्धारण करने के लिए और के विकास के लिए की जरूरत है सेल आधारित इन विट्रो और जल्दी मूल्यांकन और उपन्यास दवाओं की बेहतर सफलता दर के लिए अग्रणी मानव कोशिकाओं के लिए प्रभावकारिता स्क्रीनिंग विषाक्तता में.

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Acknowledgments

लेखकों ब्रोन्कियल ऊतकों प्रदान करने के लिए डॉ. रिचर्ड Inculet बहुत आभारी हैं. रिसर्च एथिक्स बोर्ड मंजूरी सेंट जोसेफ हेल्थकेयर हैमिल्टन और वेस्टर्न ओंटारियो / लंदन स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (डॉ. डेविड मैककॉर्मेक), ऊतक और अभिलेखागार समिति, पैथोलॉजी विभाग के विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया. हम भी Ernie स्पिट्जर (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, McMaster विश्वविद्यालय) immunostaining के लिए आवश्यक सामग्री के कुछ प्रदान करने के लिए हमारी अली संस्कृतियों के TEMs और डेनिएला Farkas प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम ओंटारियो सोसायटी छाती रोगों से एक ब्लॉक अवधि के अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, डॉ. आस्मा Yaghi एक FSORC छात्रवृत्ति, सेंट जोसेफ हेल्थकेयर, हैमिल्टन, ओंटारियो, कनाडा द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from bovine serum, powder Sigma-Aldrich A4919 Use for coating solution
COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered Sigma-Aldrich C8919 Use for coating solution
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F2006 Use for coating solution
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) Sigma-Aldrich 28888 Use for rinsing tissue and for coating solution
DMEM/Ham F-12 Sigma-Aldrich D8437
FBS Sigma-Aldrich F1015 Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed
Antibiotic-Antimycotic Stabilized Sigma-Aldrich A5955 Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed
Albumin solution from bovine serum Sigma-Aldrich A8412 BSA
Pituitary Extract Bovine Sigma-Aldrich P1476 BPE
Epidermal growth factor Sigma-Aldrich E9644 EGF
(±)-Epinephrine Sigma-Aldrich E1635
Insulin Sigma-Aldrich I6634
Tranferrin Human Sigma-Aldrich T8158
Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich T6397
Hydorcortisone Sigma-Aldrich H0888
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625
Trypsin Sigma-Aldrich T9935
EDTA Sigma-Aldrich E6758 EDTA
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368 PBS
70% ethanol Use for disinfecting and cleaning
24 well Transwells Corning 3470
Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning Fisher Scientific 05-539-104 These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth
Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody Sigma-Aldrich F3418 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution
Antibody: E-Cadherin (H108) Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-7870 Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A21207 Use 1:400 dilution
Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution
Antibody: Vimentin (RV202) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-32322 Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody
Rabbit anti-mouse TRITC Sigma-Aldrich T2402 Use 1:400 dilution
Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-1506 Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody
Donkey anti-goat IgG-FITC Santa Cruz Biotechnology, Inc. Use 1:100 dilution
Vectashield Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence duringprolonged storage
Vectashield Mounting medium Vector Laboratories H-1000 Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage
H–chst Stain solution Sigma-Aldrich H6024 Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000

Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.

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References

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प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला Explants से विकसित कोशिकाओं
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Yaghi, A., Zaman, A., Dolovich, M. Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants. J. Vis. Exp. (37), e1789, doi:10.3791/1789 (2010).More

Yaghi, A., Zaman, A., Dolovich, M. Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants. J. Vis. Exp. (37), e1789, doi:10.3791/1789 (2010).

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