यहाँ हम मानव ब्रोन्कियल airway ऊतक के एक हवा तरल इंटरफेस पर विभेदित विकास सहित explants से प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं से बढ़ के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन. इस विधि मानव फेफड़े के स्वास्थ्य और रोग में airway उपकला की भूमिका की जांच के लिए एक प्राथमिक कोशिकाओं के प्रचुर स्रोत प्रदान करता है.
इस अध्ययन में हम संस्कृति और प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के विस्तार के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत किया. हम दिखा दिया कैसे explants और ब्रोन्कियल ऊतक, मीडिया जो उपकला सेल के विकास को बढ़ावा देने…
लेखकों ब्रोन्कियल ऊतकों प्रदान करने के लिए डॉ. रिचर्ड Inculet बहुत आभारी हैं. रिसर्च एथिक्स बोर्ड मंजूरी सेंट जोसेफ हेल्थकेयर हैमिल्टन और वेस्टर्न ओंटारियो / लंदन स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (डॉ. डेविड मैककॉर्मेक), ऊतक और अभिलेखागार समिति, पैथोलॉजी विभाग के विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया. हम भी Ernie स्पिट्जर (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, McMaster विश्वविद्यालय) immunostaining के लिए आवश्यक सामग्री के कुछ प्रदान करने के लिए हमारी अली संस्कृतियों के TEMs और डेनिएला Farkas प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम ओंटारियो सोसायटी छाती रोगों से एक ब्लॉक अवधि के अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, डॉ. आस्मा Yaghi एक FSORC छात्रवृत्ति, सेंट जोसेफ हेल्थकेयर, हैमिल्टन, ओंटारियो, कनाडा द्वारा समर्थित किया गया था.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
(±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
Insulin | Sigma | I6634 | ||
Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
Trypsin | Sigma | T9935 | ||
EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.