Summary
Växtbiomassa är en stor koldioxidneutral förnyelsebar resurs som kan användas för produktion av biobränslen. Växtbiomassa består huvudsakligen av cellvägg, ett strukturellt komplexa kompositmaterial kallas lignocellulosa. Här beskriver vi ett protokoll för en omfattande analys av innehållet och sammansättningen av muren härstammar kolhydrater.
Abstract
Behovet av förnybara, koldioxidneutrala, och hållbara råvaror för industrin och samhället har blivit en av de mest angelägna frågorna för 21-talet. Detta har återuppväckt intresset för användningen av växtskyddsmedel som industriell råvara för produktion av flytande bränslen för transporter
Protocol
1. Cellvägg isolering
- slipa ungefär 60-70 mg av luft-eller frystorkade växtmaterial med 5,5 mm rostfritt stål bollar i en 2 ml Sarstedt skruvlock rör med hjälp av en retschmill (1 min, 25 Hz). Ett alternativ är att använda en hög genomströmning slipning och utlämning roboten kallas iWall beskrivs i del I 3.
- bort stålkulor innan du fortsätter med cellväggen Isoleringsförfarande
Den detaljerade protokoll för beredning av cellväggen materialet återfinns i del I 3. För fullständighetens här skriftligt steg i protokollet. - lägger 1,5 ml 70% vattenlösning etanol, och vortexa grundligt
- centrifugera vid 10.000 rpm i 10 min till pellets alkohol olösliga återstoden
- aspirera eller dekantera supernatanten
- lägger 1,5 ml kloroform / metanol (1:1 v / v) lösning på rester och skaka röret noggrant för att suspendera pelleten
- centrifugera vid 10.000 rpm i 10 minuter och aspirera eller dekantera supernatanten
- Resuspendera pelleten i 500 ul av aceton
- avdunsta lösningsmedlet med en ström av luft vid 35 ° C tills det är torrt
Vid behov torkade proverna kan förvaras i rumstemperatur tills vidare bearbetning. - För att initiera avlägsnande av stärkelse från provet återsuspendera pelleten i 1,5 ml av en 0,1 M natriumacetat buffert pH 5,0.
- cap Sarstedt rör och värme i 20 min. vid 80 ° C i ett värmeblock.
- kyla fjädring på is
- lägg till följande agenter att pelleten: 35 ìl av 0,01% Sodiumazide (NaN 3), 35 l Amylas (50 μg/1mL H 2 O, från Bacillus arter, SIGMA), 17 l Pullulanase (18,7 enheter från Bacillus acidopullulyticus, SIGMA) . Cap röret och vortexa grundligt.
- Suspensionen är inkuberas över natten vid 37 ° C i shakern. Orientera rören horisontellt medhjälpare bättre blandning.
- värme fjädring vid 100 ° C i 10 min i ett värmeblock att avsluta matsmältningen.
- centrifug (10.000 rpm, 10 min) och kassera supernatanten innehållande solubilized stärkelse
- Tvätta den återstående pellets tre gånger genom att tillsätta 1,5 ml vatten, vortexa, centriguation och dekantering av tvättvattnet.
- Resuspendera pelleten i 500 ul av aceton
- avdunsta lösningsmedlet med en ström av luft vid 35 ° C tills det är torrt. Det kan bli nödvändigt att bryta upp materialet i röret med en spatel för bättre torkning.
Det torkade materialet presenterar isolerade cellväggen (lignocellulosa). Vid behov torkade proverna kan förvaras i rumstemperatur tills vidare bearbetning.
2. Matrix Polysaccharide sammansättning
Denna metod är i huvudsak en modifiering av metoden publicerades av Albersheim 1.
- För att bestämma monosackarid sammansättningen av väggmaterial väger 2 mg cellvägg material till 2ml starstedt rör antingen för hand eller i en highthroughput sätt använder iWall, en robot slipning och väger robot.
- Tillsätt 20 uL av en Inositol lösning (5mg/ml) som intern standard. För en 2 mg cellvägg urval rekommenderar vi att lägga till 100 ug.
- Skölj röret väggar med 250 ul av aceton för att samla in det material cellväggen på botten av röret, och indunsta aceton väldigt försiktig i luftflödet.
- För svag syra hydrolys Tillsätt 250 ul av 2M trifluorättiksyra (TFA) till varje prov. Lägg TFA noga för att säkerställa att inget material stänker upp på röret väggarna.
- locket och inkubera i 90 min vid 121 ° C i ett värmeblock.
- kyla värme block och prover på is.
- Centrifugera rören vid 10.000 rpm i 10 min.
- överföra 100 ul av sura supernatanten innehållande matrisen polysackarid härrör monosackarid till ett tak av glas skruv flaskor att se att inte störa pelleten materialet. Den pellets kan användas för cellulosa-analysen nedan (se 3.)
- förånga TFA i glasrör under en svag luftström i en avdunstning enhet.
- Tillsätt 300 l 2-propanol, virvel och avdunstar vid 25 ° C (upprepa för totalt tre gånger)
- Det första steget i alditol acetat derivatisering förfarande är att göra en minskning av monosackarider till sina respektive alditols. För detta ändamål tillsätt 200 l av en natrium borohydride lösning till varje torkade prov. Bered en färsk lösning varje gång med 10 mg natrium borohydride per 1 ml 1M ammoniumhydroxid.
- Lämna glasflaska i rumstemperatur i 1,5 timmar
- neutralisera lösningen genom att tillsätta 150 ul isättika
- Vortex och förångas vid 25 ° C.
- tillsätt 250 l Ättiksyra / Metanol (01:09, v / v), Vortex och avdunstar vid 25 ˚ C
- tillsätt 250 l metanol, och indunsta i luftström (upprepa för totalt tre gånger)
- För acetylering av alditols, tillsätt 50 ìl Ättiksyraanhydrid och 50 ìl Pyridine, virvel och inkubera i 20 minuter vid 121 ° C i ett värmeblock.
- svalt prover i blocket ner med is och samtidigt vänta på temp minska till ungefär rumstemperatur.
- avdunsta reagenserna under en svag luftström vid rumstemperatur. Var försiktig: alditol acetat är mycket volatil.
- tillsätt 200 l toluen och avdunsta i luften (x3)
- I de sista stegen i alditol acetater utvinns. Lägg först till 500 ul etylacetat och snurra lätt.
- Tillsätt 2 ml vatten, rör locket och skaka.
- centrifugrör vid 2000 rpm under 5 minuter att få klar separata lager (etylacetat ovanpå, vatten på botten)
- pipett 50 ul av etylacetatet skiktet i GC / MS-flaskor med inlägg.
- späd genom att tillsätta 100 ul av aceton till GC-flaskan och locket. Provet volym och volymer utspädning kan justeras för att undvika överbelastning av GC / MS om provet halten är för hög.
GC-flaska kan förvaras vid 4 ° C, om GC / MS-analys inte omedelbart gå vidare - Proverna sprutas in i ett GC som är utrustad med en kvadrupol MS, men en flamjonisationsdetektor är också lämplig. En Supelco SP-2380 (30mm X 0,25 x 0,25 ìm filmtjocklek) kolumnen används med en 4min lösningsmedel dröjsmål och ett flöde på 1.5ml/min. Injiceras prover utsätts för följande temperatur programmet: Inledande håll vid 160 ° C i 2 min, en 20 ° C / min ramp till 200 ° C och håll nere i 5 min, en 20 ° C / min ramp till 245 ° C och håll 12 min, spik till 270 ° C och håll i 5 minuter innan du svalkar till den ursprungliga temperaturen 160 ° C 2,26) Peaks identifieras med massa profiler och / eller retentionstiderna av standarder.. Monosackarider kvantifieras baserade på standard kurvor.
3. Kristallin cellulosa innehåll
Denna metod är i grunden beskrivs av Updegraf 8. Det finns ett antal av utgångsmaterial för detta förfarande: Isolerad cellväggen material (se 1) eller väggmaterial som redan har behandlats med 2M TFA (se 2.8) antingen kvarvarande pellets direkt efter syrabehandling (se 2.8) eller en TFA pellets, som har tvättats med 2-propanol och torkas.
- Lägg till TFA pellets i skruven maximerad glasröret 1 ml Updegraff reagens (Ättiksyra: salpetersyra: vatten, 08:01:02 v / v).
- Cap röret tätt, virvel, och värme i ett värmeblock vid 100 ° C i 30 min. Som ett resultat av denna behandling bara kristallin cellulosa är olösliga i pelleten.
- Kyl proverna i blocket på is till rumstemperatur eller svalare
- Centrifugera proverna vid 10000 rpm i 15 min
- Kassera supernatanten att pelleten inte störs och inget material från pelleten tas bort. För detta ändamål lämna ca. 150 ul av supernatanten i röret.
- lägger 1,5 ml vatten, skaka, centrifug och kassera supernatanten som utförd ovan
- Upprepa tvättningen ytterligare 3 gånger med 1,5 ml aceton
- Lufttorka pellets mycket försiktigt med luft, eller låt torka på bänken över natten
- pelleten (kristallin cellulosa) är nu helt hydrolyseras till glukos av vad som kallas en Saeman hydrolys. För detta ändamål lägga till 175 l 72% svavelsyra till Sarstedt rör
- Inkubera vid rumstemperatur i 30 min, virvel och inkubera i ytterligare 15 minuter
- lägga 825 l vatten och skaka
- Centrifugera proverna vid 10000 rpm i 5 min. Det kan finnas några bruna olösligt material, lignin, som finns kvar i röret.
- Glukoshalten i supernatanten analyseras med hjälp av de kolorimetriska anthrone analysen. Denna analys görs i ett 96 väl polystyren mikrotiterplattan.
- För standardkurvan använda en 1mg/ml glukos lager (förvaras vid 0 ° C) och skapa dubbletter 0, 2, 4, 6, 8 och 10 ug standarder genom att pipettera 0, 2, 4, 6, 8 och 10 ul i separata lämpligt väl. Fyll varje brunn upp till 100 ul med vatten.
- Tillsätt 10 l av varje prov supernatanten och 90 ml vatten i separata celler, men på samma mikrotiterplatta som standard.
- tillsätt 200 ìl av nyberedd Anthrone Reagent (Anthrone löst i koncentrerad svavelsyra, 2 mg anthrone / ml svavelsyra)
- värme platta för 30 min vid 80 ° C i en ugn (aluminium värmespridare). Glukos som innehåller prover vända om från gult till blå-grönt.
- Låt plattan svalna till rumstemperatur och skaka ordentligt.
- Läs absorption av plattan vid 625 mm med en läsare mikrotiterplattan.
- Glukos (och därmed kristallin cellulosa innehåll) beräknas utifrån absorbansen i förhållande till standardkurvan fastställas på samma tallrik.
4. Representativa resultat
Ett exempel på en vägg analys presenteras i figur 2. I detta fall poppel stamceller (trä) analyserades av de olika förfaranden som beskrivs i protokollet avsnitt. Matrisen polysaccharide sammansättning är markerad med ett exempel kromatogram identifiera typiska socker som finns i växternas cellväggar, fukos, ramnos, xylos, arabinos, galaktos, mannos och glukos (och den interna standarden inositol). Den viktigaste hemicellulosic delen av poppel är xylan vilket framgår av den höga xylos innehåll. Dock kommer det överflöd av dessa socker varierar beroende på råvara Begagnat4. Sockret i denna analys kommer från hemicellulosa xyloglucan och amorfa cellulosa. På grund av analysen data kan presenteras som mol% eller ug / mg väggmaterialet (eller torrvikt). Innehållet i kristallin cellulosa är självförklarande, kan man förvänta värden mellan 20-50% av väggen torrvikt. Baserat på de resultat som presenteras här och i del I3 på lignocellulosa sammansättningen av poppel trä är 21% lignin, 30% hemicellulosa och 41% kristallin cellulosa. Resten skulle vara aska.
Figur 1:. Översikt av lignocellulosa analys cellväggar (lignocellulosa) är isolerade från råa torkade växtmaterial. Väggmaterialet är sedan vägs in i portioner och delas upp för olika analyser. Matrix polysackarid sammansättning fastställs efter behandling väggmaterialet med svag syra (2M TFA), derivatizing den resulterande solubilized monosackarider till sina alditol acetater, och analys med GC-MS. Återstoden av den svaga syrabehandling tvättas med den så kallade Updegraff reagens vilket innebär att endast olösliga crystlline cellulosa bakom. Den cellulosa är solubilized av svavelsyra och kvantifieras av en kolorimetrisk analys bestämma glukoshalten. Parallellt kan innehållet och sammansättningen av lignin bestäms enligt anvisningarna i del I 3.
Figur 2:. Omfattande lignocellulosa analys av poppel trä träflis från poppel (Populus tremoloides) blev utsatt för beskrivs protokollet.
Övre vänster: Matrix polysackarid sammansättning, Fuc fukos, RHA ramnos, Ara arabinos, XYL xylos, Människan mannos, Gal galaktos, Glc glukos, inositol intern standard.
Discussion
De beskrivna metoderna möjliggör en snabb kvantitativ bedömning av sammansättningen av lignocellulosa växtbiomassa. Metoden gör det möjligt att bestämma sammansättningen av sådana material inklusive sockret sammansättningen av matrisen polysackarider nämligen hemicellulosa, den kristallina cellulosan innehåll. Genomströmningen av olika analysmetoder per person varierar. Med hjälp av protokoll som beskrivs här, kan 20 prover behandlas för matris polysackarid kompositioner och 30 för kristallin cellulosa innehåll. På grund av den kvantitativa typ av uppgifter optimala grödor som råvara kan sort eller genotyper bedömas i termer av deras lämplighet för produktion av biobränsle.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Matthew Robert Weatherhead för utmärkt teknisk service och John Ralph, University of Wisconsin för värdefulla råd, diskussioner och poppel trä provet. Detta arbete har finansierats av Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (tilldelning nej. DE-FG02-91ER20021) och av US Department of Energy (DOE) Stora sjöarna Bioenergi Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| myo-Inositol | Sigma-Aldrich | I5125 | |
| Sodium Borohydride | Sigma-Aldrich | 213462 | |
| Pyridine | JT Baker | 3348-01 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
| Spectromax Plus 384 | Molecular Devices | Plus384 | |
| GC-MS | Agilent Technologies | 7890A GC/5975C MSD | |
| 5.5mm Stainless Steel Balls | Salem Ball Company | (N/A) | |
| 96 well plate heat spreader | Biocision | Coolsink 96F | |
| Retsch Mill | Qiagen | TissueLyser II | |
| Heating block | Techne | Dri-block DB-3D | |
| Sample concentrator | Techne | FSC400D |
References
- Albersheim, P. A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).
- Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic Biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).
- Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).
- Somerville, C. Toward a systems approach to understanding plant-cell walls. Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).
- Teeri, T. T., Brumer, H. Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases. Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).
- UPDEGRAF, D. M. SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS. Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).
